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监测细胞红蛋白在原代神经元在缺氧时的表达

更新时间:2020-08-06 08:18点击:

   摘要:目的探讨细胞红蛋白(cyto globi n,CYG B)在体外培养神经元缺氧时的表达,为研究缺氧缺血性脑病(h y-po x icischemice ncephalopathy,HI E)的生理病理机.制及寻求该病新的治疗方法提供实验基础。方法运用无血清培养技术进行胎鼠皮质神经元原代培养6 d;先用神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学方法纯度鉴定,然后随机分配为4组,将其中3组(第1组作为对照)置于0. 5%~0.9%的O 2中,用CC K 8试剂盒测试细胞生存率,同时用R e a 1- t i me PCR和West ern-bl。t观察CYGB在神经元正常及缺氧不同时间点(8h,16h,24h)核酸及蛋白的表达情况。结果神经元纯度鉴定纯度大于99%;缺氧后神经元生存率随着时间推移降低,但绝大部分神经元仍存活; C YG B核酸及蛋白的表达随缺氧时间增长而递增,且 每组之间差异有统计学意义(P<0. 0 5)。结论在体外培养的神经元细胞中,缺氧可以促进C YG B的表达,提示C Y G B在缺氧性神经损伤中可能发挥某种特定的生理功能。
 
   关键词:细胞红蛋白;原代神经元;缺氧缺血性脑损伤
 
细胞红蛋白(cytoglobin)是由190个氨基酸组成的21-kDa蛋白。它的三级结构具有经典的珠蛋白8个螺旋(A至H),这8个螺旋折叠成三明治结构。与肌红蛋白、血红蛋白不同,细胞红蛋白是一个六配位蛋白。哺乳类动物的细胞红蛋白广泛分布于肝脏,心脏,脑,肺,视网膜,食管,肠等各个器官。在大部分器官中,它分布在纤维母细胞及间充质细胞的细胞质,而在脑神经元中,它在细胞质及细胞核中均有分布,提示着它在脑中具有某种特殊的生理功能。自2001年发现细胞红蛋白以来,越来越多的研究结果表明它在缺氧应激状态时时扮演着保护组织、细胞的重要角色。神经细胞是大脑的基本功能单位,承载着大脑的感觉,运动,记忆,思维等各种生理功能。临床上治疗HIE时,我们最关心的是神经元的存亡,这和病人的预后有很大的关联。但迄今为止,关于细胞红蛋白在体外培养的原代神经元缺氧时表达的研究尚无。本实验通过Real-timePCR及Western-blot监测细胞红蛋白在原代神经元在缺氧时的表达,为研究细胞红蛋白在缺氧应激神经细胞中的调节通路提供实验基础,从而进一步为缺氧缺血性脑病中的治疗奠定基础。
 
  1材料和方法
 
  1.1 实验动物、主要试剂与仪器 孕18d的SD大鼠,由汕头大学医学院实验动物中心提供。L-GLU-TAMINE(GIBCO),DMEM/F12培养基(GIBCO),B27神经营养因子(INVITROGEN),TRYPSIN+0.25% EDTA(GIBCO),NEUROBASAL(GIB-CO),多聚-D-赖氨酸 (SIGMA),REALTIME-PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司),即用型免疫组化试剂盒(福州迈新),烯醇化酶一抗(福州迈新)及兔抗鼠二抗(福州迈新),β-actin一抗(武汉博士德),胞红蛋白一抗(SANTA),羊抗兔二抗(博奥森),倒置相差显微镜(日本O-LYMPUS公司),CO2培养箱(苏州净化设备),荧光定量PCR仪(LIFE),全能显微镜(LEICA),测氧仪(上海华光),酶标仪(Bio-rad)。
 
  1.2 方法
 
  1.2.1细胞的培养冰上取孕18d的胎鼠大脑皮层,用0.062 5%消化后,加用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基吹打成悬液,用台盼蓝染色进行细胞计数,以25万/cm2种植于预先用多聚赖氨酸包被的六孔板(PCR及免疫印迹试验用)及96孔板内(cck8用),置于37℃,5%CO2的培养箱中进行培养,4h细胞贴壁后换NEUROBASAL +2%B27+L-GLUTAMINE继续培养,每48h换液1次,培养至第6天用神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组织化学方法神经细胞进行纯度鉴定。
  1.2.2神经元纯度鉴定吸净培养基,用2%多聚甲醛固定,甲醇双氧水浸泡,加山羊血清封闭,加一抗(对照组用pbs代替),置4°冰箱过夜。第2天PBS浸洗后,加二抗30min,加辣根过氧化物酶60min,PBS浸洗后,滴加DAB显色约5min(显微镜下观察显色情况),PBS冲洗,晾干,树胶封片。显微镜下随机选取10个视野计数。
  1.2.3细胞缺氧。实验前将培养基5%CO2和95%N2的气体中过夜。实验时,将细胞随机分为4组,其中1组作为正常组(0h),其余3组培养基换为预缺氧的培养基,然后充入5%CO2和95%N2的气体的真空袋中,分别缺氧8h,16h,24h,缺氧后用测氧仪监测气体的氧浓度,氧气浓度在0~0.9%之间的进行下一步实验。
  1.2.4荧光定量。PCR用Trizol(Takara)、氯仿、异丙醇、75%乙醇裂解细胞分离沉淀mRNA,适当的DEPC水 溶 解mRNA,紫 外 分 光 光 度 计 测 定RNA浓度和OD值(1.8~2.1),在逆转录酶作用下,将mRNA逆转录成cDNA。采用荧光染色技术进行实时定量多聚酶链反应(polymerase chain re-action,PCR),获取各组标本标准曲线,计算机分析Ct值。7300系 统 的PCR的 反 应 条 件:第 一 阶 段95℃30s;第二阶段95℃3s,60℃31s,40个循环;第三阶段95℃ 15s,60℃ 1min 95℃ 15s,PCR引物设计如下。CYGB基因,引物为5'-CCTGGTGAG-GTTCTTTGTGAAC-3'(上游),5'-CAGAATGAC-CCCAGAGAGAATC-3'(下 游)。β-actin(内 参)基因,引物为5'-ACCCTGAAGTACCCCATTG-3'(上游),5'-TACGACCAGAGGCATACAG-3'(下游)。
  1.2.5免疫印迹试验加50μL/孔单去污剂裂解液(含PMSF100∶1)于六孔板内,超声波震荡,置冰上裂解30 min后,移至1.5 mL离心管中,4℃下12 000r/min离心5min,取上清并分装于0.5mL离心管中,保存于-20℃冰箱中备用。总蛋白质抽提上样,SDS-PAGE分离后电转移至PVDF膜上,用10%脱脂牛奶封闭液室温封闭2h后,加入鼠抗人的CYGB多克隆抗体(1∶200)和β-actin(1∶1 000),4℃孵育过夜,TBST洗膜10min×3次,后加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗(1∶10 000),水平摇床中晃动,室温孵育2h,TBST洗膜5min×4次,暗室曝光。用Quantity One图像分析系统对分析系统对Western blot结果进行分析。
  1.2.6细胞活力实验每个缺氧组设置三个复孔神经元,缺氧前吸静培养基,PBS洗净后每个孔加CCK8试剂100μL,培养2.5h,酶标仪测量OD1值。
  缺氧后再吸静培养基,PBS洗净后每个孔加CCK8试剂100μL,培养2.5h,酶标仪测量OD2值。算出各组的相对OD值:OD=OD2/OD1,分别用8h、16h、24h与0h组比较计算出缺氧后各组细胞的生存率。
  1.3 统计学方法所有数据以x-±s表示,多组计量资料采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。
 
  2结果
 
  2.1 神经元纯度鉴定及细胞缺氧 SD大鼠大脑皮层神经元培养及鉴定 培养6d的海马神经细胞生长状态良好,胞体饱满,多呈梭形、锥形,少数呈多边形,胞浆丰富,核大,核仁隐约可见,突起联结成网,神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组织化学方法纯度鉴定结果显示神经元纯度大于99%。见图1。细胞缺氧后,测氧仪监测的氧浓度波动于0.5% ~0.9%之间。
2.2 荧光定量PCR 相对于正常组,缺氧组CYG-BmRNA随着缺氧时间逐渐升高:8h,16h,24h分别是0h组的(1.22±0.21)倍,(1.47±0.28)倍,(1.74±0.39)倍,且每组(n=12)之间差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。各组比值见表1。
2.3 免疫印迹试验 相对于正常组,缺氧组CYGB随着缺氧时间逐渐升高:8h,16h,24h分别是0h组的(1.54±0.21)倍,(2.18±0.28)倍,(3.03±0.4)倍,且每组(n=4)之间差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图3。
2.4 细胞活力实验结果 随着缺氧时间延长,生存率降低:8h,16h,24h分别是0h组的(0.98±0.01)倍,(0.96±0.01)倍,(0.95±0.01)倍,且每组(n=12)之间差异有统计学意义(P<0.05)。见图3,见表3。
3讨论
 
  本实验神经元纯度达到99%以上,氧浓度在0.5%~0.9%,确保了试验的准确性。细胞活力试验结果显示缺氧后神经元并没有大量死亡(损伤最严重24h组仍有95%存活率),这或许和老鼠神经元长期处于一种低氧压的环境有关。众所周知,活细胞是产生核酸和蛋白的基础,因此缺氧后神经元的高存活率保证了有足够的神经细胞产生CYG-BmRNA和蛋白,从而能真实反映CYGB在神经细胞缺氧时如何表达。本实验荧光定量PCR及Westernblot结果首次证实了低氧使神经细胞在核酸水平和蛋白水平都过表达CYGB。这与前人在其他组织及细胞上做的实验结果相符,E Fordel等证实了在缺氧的心、肝、肌肉、脑中,CYGB含量升高。在体外缺氧实验中,多种癌细胞包括神经肿瘤细胞株HN33、支气管上皮癌细胞株BEAS-2b、宫颈癌细胞株HeLa、多形胶质细胞瘤细胞株中的CYGB含量均增高。增高的程度与缺氧的时间和严重程度成正比。有趣的是,在本试验中,相对于正常组,核酸的升高倍数与蛋白的升高倍数并不平行,蛋白每个时间点的升高倍数都略高于核酸组,这或许与翻译过程和翻译后的加工、修饰有关。细胞红蛋白(CYGB)是在高等脊椎动物上发现的第四种珠蛋白,它广泛分布于人体各个组织器官。有学者推测它同样具有储氧和运输氧的功能。
  D Hamdane等推测缺氧环境下H+、NADH等还原性物质的存在使CYGB产生变构而易于释放氧,从而使其可以有效的行使储氧及运输氧的功能。有研究证实了CYGB具有过氧化物酶和超氧化物歧化酶的作用,它可以利用亚铁原卟啉和硫醇残基清除活性氧 (ROS)。人 为 的 使CYGB过表达能在氧化应激是保护细胞,清除活性氧(ROS),脂源性活性物质,降低DNA的损伤,提高细胞的生存率。敲除CYGB则会使ROS清除速度减慢,细胞凋亡率增高。 围生期缺氧缺血性脑病(HIE)一直是新生儿致畸和致残的重要原因,足月新生儿的发病率约为2~4/1 000,早产儿的发病率更高。脑损伤是不可逆的疾病,有着大脑性麻痹,精神发育迟缓,学习障碍,癫痫等多种严重的后遗症。缺氧使脑细胞线粒体功能失调,能量代谢障碍。随之而来的是氧自由基、ROS、脂质过氧化物的产生从而导致胞内蛋白,DNA的损伤,细胞的坏死,凋亡。因此,及时的清除氧自由基,脂质过氧化物酶可以更好的保护脑细胞。近十年来,尽管人们做了大量的研究,但是还没有一套对HIE行之有效的治疗方法,开发一些新的治疗方法势在必行。
  CYGB的功能和它在脑内的广泛分布使它成为了治疗缺氧缺血性脑病HIE的候选者之一。在缺氧应激的情况下,人为的增加CYGB表达和敲除CYGB分别能提高细胞的生存率和降低细胞的死亡率以及减少和增加脑组织的死亡面积。但是,之前的试验之前的实验虽有证实了CYGB与大脑缺氧之间的关系,但是大脑中细胞种类繁多,并不能直接说明在缺氧情况下CYGB与神经元的直接关系。然而临床上治疗HIE时,我们最关心的正是神经元的存亡,这和病人的预后有很大的关联。本试验表明神经元在缺氧时确实会上调CYGB,结合证实的CYGB在缺氧时对细胞的保护作用和缺氧后绝大部分神经细胞存活,我们推测CYGB在缺氧应激可以通过清除自由基,脂源性活性物质等作用中保护神经细胞,增强神经元对缺氧的耐受能力,提高神经细胞缺氧时的生存率。因此,CYGB或许可能成为治疗HIE的新途径。
  然而,CYGB与缺氧应激的关系及它的功能尚存在着一些争议。D Li等将神经母细胞瘤细胞株N2a置于5%(38.5mmHg)的氧中,并未 发 现CYGB升高。这或许和实验设计的氧压过高有关,正常情况下哺乳类动物大脑皮层的平均氧压(34.1+5.6)mmHg,而神经母细胞瘤是神经细胞来源的。因此,5%的氧对于N2a细胞株可能并不算“缺氧”刺激。有学者结扎大脑中动脉后发现梗死区的CYGB并未增高。但是他们在检测CYGB时,梗死区域细胞已经完全坏死,而且检测是在24h之后,并不能排除在细胞未完全坏死时的24h之 内CYGB已经开始升高。
  HIE早期细胞未完全坏死,因此Zindy Raida的结论并不能说明CYGB的表达与HIE无关。综上所述,神经细胞在缺氧时将会上调CYGB,这种CYGB的上调或许是神经细胞的一种自我保护机制,因此,CYGB可能成为改善HIE预后的潜在途径之一。当然,这还有很长的一段路要走。首先,本实验并未在神经细胞内敲除和过表达CYGB来测试它是否真的具有保护作用。其次,本实验并未探讨它的上下游基因,并不了解它的作用机制。将来的实验需要进一步验证这些问题。
 
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