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铁硫蛋白的结构、功能与生物合成综述

更新时间:2020-09-27 08:50点击:

   摘要 铁硫蛋白是以铁硫簇为辅基,相对分子质量较小的一类蛋白质。它广泛存在于各种生物体内,参与电子传递、能量代谢以及基因表达调控等重要生理过程。其生物合成过程复杂, 并且从细菌到人类高度保守。在真核细胞内,铁硫蛋白的组装由线粒体铁硫簇组装系统( mi tochondrial iron-sulfur cluster assemblysystem, mi tochondrial ISC assembly system)和细胞质铁硫簇组装器 ( cytosoliciron- sulfur clusterassembly, CIA)完成。研究发现,铁硫蛋白的合成异常可导致弗里德赖希共济失调( friedreichataxia, FRDA)、遗 传性肌病和铁粒幼细胞性贫血等多种罕见疾病,这些疾病严重影响个体的生活质量和寿命因此,深入了解铁硫蛋白的结构和生物合成过程,对研究其生物学功能与相关疾病的诊断和治疗有重要意义
 
   关键词铁硫蛋白;生物合成;线粒体铁硫簇组装系统 ;细胞质铁硫簇组装器
 
自上世纪 60 年代发现铁氧化还原蛋白(ferredoxin) 以来,人类已发现了超过 120 种含铁硫簇的蛋白质和酶,即铁硫蛋白 ( iron-sulfurprotein)[1]. 铁硫簇 ( iron-sulfur cluster,ISC) 是生物体内最古老的无机辅助因子之一,它作为蛋白质的活性基团,参与调节酶活性、线粒体呼吸、核糖体和辅助因子合成,以及基因的表达调控[2]. 近 10 年来发现,多种疾病的发生均与铁硫蛋白生物合成异常有关,把铁硫蛋白的研究推向新的高潮。 而国内对铁硫蛋白的研究甚少,有文献报道亦是侧重结构和生物合成的简要叙述。 本文就铁硫蛋白的结构、功能与生物合成过程作一综述,并介绍铁硫蛋白相关疾病的发生机制。
 
  1 铁硫蛋白的结构与功能
 
  铁硫簇由铁离子和硫离子组成,它既可作为电子传递蛋白质的辅基参与能量转移,又可作为某些酶的活性基团参与各种生化反应。 铁硫簇中的铁离子常与蛋白质的半胱氨酸残基结合,少量与组氨酸、精氨酸、色氨酸残基结合[3]. 最简单的铁硫簇只含有 1 个铁原子,与 4 个半胱氨酸的硫原子结合形成四面体,即 Fe-(Cys)4簇。 最常见铁硫簇是菱形的[2Fe-2S]簇和立方体的[4Fe-4S]簇[4,5]. [2Fe-2S]簇由 2 个铁离子和 2 个硫离子构成,其中每个铁离子还与 2 个半胱氨酸残基结合。 目前认为,[4Fe-4S]簇是由 2 个[2Fe-2S]簇重组而形成的,即 4 个铁离子和 4 个硫离子相间排列在正六面体的 8 个顶角处,此外每个铁离子还与 1 个半胱氨酸残基相连。 某些蛋白质如呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ结合有[3Fe-4S]簇,被认为是由[4Fe-4S]簇丢失 1 个铁离子形成的。 近年来,逐渐发现结构较复杂的铁硫簇,如施氏芽孢杆菌和巴氏着色菌的 ferredoxin 中分别含有[7Fe-8S]、[8Fe-8S]簇,固氮菌的铁钼蛋白中有[7Fe-9S-Mo]簇[6]. 在生物体内 1 种蛋白质可结合多个多种铁硫簇,如呼吸链复合物Ⅰ含 8 个铁硫簇[7,8],呼吸链复合物Ⅱ含有[2Fe-2S]、[3Fe-4S]、[4Fe-4S]簇。
  
  各种铁硫簇镶嵌到脱辅基蛋白(apo-protein)中形成多种铁硫蛋白,共同完成各种生物学功能。 最主要的功能是参加各种氧化还原反应,这是因其辅基中的铁离子能在 Fe2 +和 Fe3 +间互相转换[9]. 在人细胞中发现数十种铁硫蛋白。 如分布在线粒体的呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,顺乌头酸酶、硫辛酸、生物素合成酶和铁氧化还原蛋白等,它们参与电子传递、三羧酸循环、脂肪酸氧化以及硫辛酸、生物素、铁硫簇等多种物质的合成[10]. 此外,分布在细胞质和细胞核的异丙基苹果酸异构酶、亚硫酸还原酶、谷氨酸脱氢酶、黄嘌呤脱氢酶、DNA 糖基化酶和组蛋白乙酰转移酶等,它们参与 DNA 复制、修复、tRNA 的修饰、端粒长度的维持和蛋白质翻译等过程的调节[11]. 可见铁硫蛋白是多种生化过程的关键酶,其结构功能异常与合成障碍均可引起机体代谢异常或功能紊乱,甚至导致死亡。
 
  2 铁硫蛋白的生物合成过程
 
  目前,在体外可以通过化学重组的方法合成铁硫簇,并且可将其组装到对应的脱辅基蛋白中[12].早期对铁硫蛋白生物合成的认识来源于原核生物。
 
  原核细胞内铁硫蛋白的合成由固氮系统(nitrogenfixation system)、铁硫簇组装 系 统 ( ISC assemblysystem) 和硫同化系统( sulfur assimilation system) 完成[13,14]. 而在真核细胞中,其合成则相对复杂,分为线粒体内和线粒体外合成 2 条途径,分别由线粒体铁硫簇合成系统(mitochondrial ISC assembly system)和细胞质铁硫簇组装器(cytosolic iron-sulfur clusterassembly,CIA) 完成。 铁硫蛋白的生物合成过程在酵母和人类中有高度的保守性[15]. 目前,已发现 ISC系统由 17 种蛋白质,CIA 系统由 8 种(酵母)至 9 种(人类)蛋白质组成 (Table 1)。 本文主要以酿酒酵母为例,对真核生物铁硫蛋白的生物合成进行详细阐述。
 
  2. 1 铁硫蛋白在线粒体内的合成
 
  线粒体是真核细胞铁硫蛋白合成的关键部位。组成线粒体 ISC 系统的 17 种蛋白质几乎均为细胞所必须,任何成分的缺失都会导致酵母细胞的死亡。ISC 系统是一个复杂的多步骤合成系统,根据反应的进程,人为地将线粒体内铁硫蛋白合成分 3 步(Fig. 1)。
  
  2. 1. 1 在支架蛋白 Isu1 上合成[2Fe-2S]簇 在酵母线粒体内有一种保守的支架蛋白 Isu1,它在铁硫簇合成过程中作为反应平台[20]. 半胱氨酸脱硫酶Nfs1 能够催化半胱氨酸生成丙氨酸和硫离子,新生成的硫离子结合到 Nfs1 的半胱氨酸残基上形成过硫化物(-SSH)。 Nfs1 与 LYRM 家族中的 Isd11 结合,形成复合物 Nfs1-Isd11,Isd11 起稳定 Nfs1 的作用[21]. 含-SSH 的 Nfs1-Isd11 复合物与 Isu1 紧密地结合后,将其中 1 个 S2 -转移到 Isu1 上。
 
  合成铁硫簇还需要 Fe2 +作为原料,Fe2 +经线粒体膜转运蛋白 Mrs3/4 转运到线粒体基质。 Fe2 +再经具有铁结合功能的 Yfh1 蛋白(人类 Frataxin)运输至Nfs1-Isd11-Isu1 复合物。 Fe2 +从 Yfh1 转移至 Isu1,并与 S2 -相互作用生成[2Fe-2S]簇,此时新生成的[2Fe-2S]簇以松散状态结合在 Isu1 上。 Yfh1 在铁转运过程中发挥关键作用,异常时可导致酵母细胞铁堆积。 Gerber 等[22]和 Schmucker 等[23]发现,人类Frataxin 与 NFS1-ISD11-ISU1 复合物结合失败时,会导致红细胞内铁超载。 此外,Frataxin 对 NFS1 有变构调节的作用,当反应过程中所有成员都出现时,Frataxin 会激发 NFS1 的活性[24].
 
  在[2Fe-2S]簇合成时,还需要由 NAD(P)H、铁氧化还原蛋白 Yah1 和铁氧化还原蛋白还原酶Arh1( ferredoxin reductase,Arh1 ) 构成的电子链参与[25]. Yah1 本身就是[2Fe-2S]蛋白,在 Arh1 作用下被还原,释放的电子经 NAD(P)H 转移到 Isu1的-SSH 上。
 
  2. 1. 2 分子伴侣协助[2Fe-2S]簇转移到 Grx5[2Fe-2S]簇在 Isu1 合成后,要进一步组装到目标蛋白质上,中途需要热休克蛋白70(heat shock protein,Hsp70)分子伴侣系统和谷氧还蛋白 5(glutaredoxin5,Grx5) 协助其解离及转运。 Hsp70 分子伴侣系统包括腺苷三磷酸酶 Ssq1、DnaJ 样分子伴侣 Jac1、核酸交换因子 Mge1[26-28]. Ssq1 与 Isu1 的功能类似,作为支架蛋白质提供反应平台[16]. Jac1 通过 J 结构域与Isu1 结合,募集下游分子聚集[29]. Mge1 在运输后期出现,将 ADP-Ssq1 转化为 ATP-Ssq1,使结合在 Ssq1的各组分解离[30]. Grx5 是 1 种铁硫簇转运蛋白,通常以二聚体的形式存在,能够通过半胱氨酸残基活性位点与[2Fe-2S]簇结合。
 
  首先,[2Fe-2S]簇与 Isu1 结合形成 Holo-Isu1复合物,接着 Jac1 特异地与 Holo-Isu1 结合,形成Jac1- Holo-Isu1 复合体。 该复合体能结合 ATP,启动下游反应,这导致 ATP-Ssq1 变为 ADP-Ssq1. Isu1 的保守 LPPVK 环与 Ssq1 的多肽结合位点嵌合,形成Jac1-Holo-Isu1-ADP-Ssq1 复合物。 Ssq1 与 Isu1 结合后,其构象发生改变,进一步增强与 Isu1 的结合。 而Isu1 自身结构却变得松散,与[2Fe-2S]簇和 Jac1 的结合力均减弱,使得 Jac1 从复合物中分离。 随后apo-Grx5 向 Ssq1 靠近,并与之结合。 Ssq1 以不同的位点同时结合 Isu1 和 Grx5,拉近了两者的距离,提高 [2Fe-2S]簇从 Isu1 移至 Grx5 的效率[31]. 反应后期,Mge1 出现并结合至 Ssq1 上,驱使 ADP 转换为ATP,最终导致结合在 Ssq1 上的组分都解离[32]. 此时 Grx5 携带的[2Fe-2S]簇经 ISC 途径或 CIA 途径,继续参与铁硫蛋白合成的后续过程。 而 Isu1 和其它分子伴侣将进入下一个周期,参与下一个铁硫簇的转移。
 
  Ssq1、Jac1、Mge1、Grx5 都是线粒体铁硫蛋白合成的重要成员,它们基因的缺失会直接降低酶活性和出现细胞内铁的堆积等[33]. 另外,此步反应还产生了一种功能仍不清楚的含硫复合物(X-S),并已证实 X-S 经过载体运输到线粒体外后,可以调控胞质铁硫蛋白的合成。
 
  2. 1. 3 铁硫簇目标因子协助 [4Fe-4S]蛋白合成第二步中释放出来的[2Fe-2S]簇,可直接与脱辅基蛋白质或多肽链中氨基酸残基结合形成[2Fe-2S]蛋白,而[4Fe-4S]蛋白的形成相对较复杂。[4Fe-4S]簇是由 Grx5 上的[2Fe-2S]簇变构重组而成,这中间需要 3 种蛋白质参与,包括在 Isa1、Isa2 和四氢叶酸结合蛋白 Iba57,三者称为 ISC 目标因子(ISC targeting factors)[34]. 三者是[4Fe-4S]蛋白合成的特异因子,单个基因缺失后,铁硫蛋白依然可以合成,这与它们在功能上存在互补作用有关。 但三者是如何相互协调促进[4Fe-4S]簇合成的机制尚不明确。 现已知 Isa1 和 Isa2 在体内外都具有铁结合功能,人们仍在探索它们的生理功能,试图不断完善该机制。
 
  Ind1、Nfu1、Aim1 是 3 个具有特异性绑定及运输[4Fe-4S]簇功能的分子。 Ind1 可短暂结合[4Fe-4S]簇并将其输送到呼吸链复合体Ⅰ上,使复合体Ⅰ具有完整功能[35]. 相对来说,Nfu1 作用更广泛,除了参与复合体Ⅰ的成熟外,还参与复合体Ⅱ和硫辛酸合酶(lipoate synthase)等多种蛋白质的成熟[36].
 
  Aim1 与 Nfu1 的功能相似,两基因缺失后的表型相同,这是由于它们具有相互协调作用。 也有某些[4Fe-4S]蛋白的合成不需要这些特异性分子的参与,如顺乌头酸酶。经过上述 3 步反应后,线粒体内多种[2Fe-2S]、[4Fe-4S]蛋白被合成,它们以酶或功能蛋白质的形式参与各种重要的生化过程。 值得注意的是,虽然将线粒体内铁硫蛋白的生物合成过程分 3 步讲述,但实际上是互相重叠,同时进行的。
 
  2. 2 铁硫蛋白在线粒体外的合成
 
  随着对铁硫蛋白生物合成过程的研究加深,人们发现了位于线粒体之外的铁硫蛋白合成系统-CIA 系统。 CIA 系统专门参与细胞质和细胞核铁硫蛋白的合成,而有别于 ISC 系统。 CIA 系统成员缺失后,主要影响细胞质和细胞核的铁硫蛋白,而不会影响线粒体内铁硫蛋白的合成。 相反,线粒体 ISC 系统成员的异常会明显地干扰细胞质铁硫蛋白的合成。
 
  如 ISC 系统的 Isu1、Nfs1-Isd11 和载体 Atm1(人类ABCB7) 的异常,将导致线粒体外硫蛋白合成减少[37]. 特别是 Atm1 的缺失,无法将含硫复合物运输至线粒体外,从而影响线粒体外铁硫蛋白的合成。 在酵母、斑马鱼、小鼠和人类细胞中,表现出铁硫蛋白的含量减少或活性降低的表型[38]. 在线粒体外合成的铁硫蛋白大多是[4Fe-4S]蛋白,大致可以分为两步(Fig 2)。
 
  2. 2. 1 [4Fe-4S]簇的合成 Cfd1 和 Nbp35 都属于 NTPases 家族成员,一般以 2Cfd1-2Nbp35 四聚体形式存在,在合成过程中既起支架作用,又可以绑定 2 对[4Fe-4S]簇。 其中 1 对[4Fe-4S]簇的合成需要线粒体提供含硫复合物作为原料,含硫复合物经线粒体膜 Atm1 载体运出,在 Cfd1-Nbp35支架上合成,然后结合至 Cfd1. 另 1 对[4Fe-4S]簇的合成则需要 NADPH-Tah18-Dre2 电子链的参与,Dre2 本身就是[2Fe-2S]蛋白,在 Tah18 的还原下,[2Fe-2S]簇被释放,其中的电子来自 NADPH. 2 个[2Fe-2S]簇经重组后形成[4Fe-4S]簇,并绑定到Nbp35 的 N-氨基末端,最终 Cfd1-Nbp35 绑定了 4个[4Fe-4S]簇。
 
  2. 2. 2 [4Fe-4S]簇至脱辅基蛋白质的转移 此阶段 需要 Nar1 蛋白 和 CIA 目标复合物 ( CIAtargeting complex) 的共同参与[40]. Nar1 与 ISC 系统中 Grx5 的功能类似,可捕获 Cfd1-Nbp35 上的[4Fe-4S]簇,起转运作用。 Nar1 缺失后,酵母细胞质铁硫蛋白合成受阻,对氧化剂敏感,ROS 含量升高,细胞受损,寿命缩短[41,42]. 近期发现,在 Nar1运载[4Fe-4S]簇时,还有与 Grx5 同家族的 Grx3,Grx4 的协助[43,44]. Grx3,Grx4 能 绑 定[2Fe-2S]簇,调节细胞内铁平衡。 CIA 目标复合物包括 Cia1、Cia2 和 Mms19,其中 Cia1 和 Cia2 是酵母生存的必需蛋白质。 Cia1 是分子量为 WD40-repeat 蛋白家族成员之一,有 1 个β螺旋和 7 个反向片层结构,能够与 Nar1 特异地结合,是 CIA 目标复合物的活性结合位点[45]. Cia2 含有 1 个高度活跃的半胱氨酸残基,其能够与铁硫簇中的铁离子结合并发挥搬运作用。 Mms19 不是酵母生存的必需蛋白质,但是缺失后会使酵母寿命缩短,HeLa 细胞复制代数减少,小鼠胚胎早期死亡[46,47]
. 研究发现,Mms19 缺失菌株的转录因子 Rad3(DNA 解旋酶)的表达量降低[46]. 在这个传递过程中,铁硫簇的结构也发生改变,使它们能够镶嵌到多种脱辅基蛋白质的活性位点中,形成各种铁硫蛋白。
 
  细胞质内组装成熟的铁硫蛋白,在细胞内经过分选后进入相应的亚细胞器,细胞核铁硫蛋白则在其携带的核定位信号 (nuclear localization signal,NLS) 的指引下主动运送到细胞核,最终发挥它们的生物学功能。
 
  3 铁硫蛋白相关性疾病铁硫蛋白合成的异常会影响
  
  酵母的寿命和抵御环境压力的能力。 而在人类中则会引发多种疾病,这些疾病统称为铁硫蛋白相关性疾病。 目前,已确定人类十余种疾病与 ISC 或 CIA 系统成员的基因有关(Table 2),其中较常见的是弗里德赖希共济失调(friedreich ataxia,FRDA)、遗传性肌病 (hereditarymyopathy) 和铁粒幼细胞性贫血 ( sideroblasticanemia)[48]. 这些疾病虽然比较罕见,但是会严重影响患者的生活质量和寿命[16].
 
  FRDA 是因神经元进行性变性坏死,导致以中枢神经系统损害为主的 1 种常染色体隐性遗传病[49]. 正常人 FXN 基因( 编码 Frataxin 蛋白) 第 1 个内含子含有 8 ~33 个 GAA 重复序列,而 FRDA 患者常多于 90 个,并且异常重复次数越多,病情越严重[50]. GAA 序列重复扩增会阻碍 FXN 基因的转录,导致患者细胞内 Frataxin 表达量减少[51]. 而Frataxin 正是线粒体基质内将 Fe2 +转运到支架蛋白ISCU 上的重要运载体。 Frataxin 的缺乏会导致铁硫簇合成障碍,患者体内呼吸链复合物Ⅰ、顺乌头酸酶、琥珀酸脱氢酶等多种以铁硫簇为辅基的蛋白质的酶活性和含量均降低[52]. 线粒体电子传递和三羧酸循环的失调,会导致机体能量供应不足。 此外,线粒体内铁的利用减少,导致线粒体内铁不断堆积,而铁硫簇匮乏,形成负反馈,使更多的铁被转运至线粒体,引发铁的恶性积累[53]. 铁本身也是一种氧化损伤剂,大量积累必然导致细胞损伤、凋亡甚至坏死。
 
  目前认为,Frataxin 的缺乏会导致线粒体功能受损,进而引发多条细胞信号通路发生改变,放大了Frataxin 缺失的生理学效应,这也是致使 FRDA 患者出现全身功能衰退的直接原因。遗传性肌病是以全身骨骼肌萎缩为主要特征,患者在轻微运动后易出现劳累、肌肉酸痛、呼吸短促等症状的终身运动耐受疾病[54]. 经过大量研究发现,患者多因 ISCU 基因(编码支架蛋白 ISCU)第 3个外显子的第 149 个碱基发生了 G→A点突变,导致 ISCU 的第 50 位上的甘氨酸被谷氨酸取代[55];此外,ISCU 的第 7 044 个碱基发生 G→C突变,会导致终止密码子的提前出现,使蛋白质翻译提前终止[56];这两种突变都影响细胞内正常 ISCU 的含量和功能。 患者在非急性期时检查显示,呼吸链复合物Ⅲ、顺乌头酸酶、琥珀酸脱氢酶等活性下降,肌肉病理切片出现肌细胞数减少并萎缩;急性期时可出现血氧饱和度下降,血乳酸和丙酮酸浓度升高,重者甚至出现横纹肌溶解和肌红蛋白尿[57]. 这类患者的ISCU 合成异常,使得铁硫簇合成时缺少促进铁离子和硫离子相互作用的平台。 从而导致铁硫簇的合成受阻,线粒体功能受损,特别是呼吸链功能不全,氧利用降低。 因此,患者较正常人对缺氧更敏感,糖酵解途径增强,相应地乳酸、丙酮酸等有害物质增多,其中骨骼肌需氧量最大,受损最为严重。
 
  铁粒幼细胞性贫血是较为常见的铁硫蛋白异常相关疾病,多见家族聚集发病。 患者的 GLRX5 基因第 1 个外显子最后 1 个密码子的第 3 个碱基发生了A→G突变,导致错误的剪接识别位点出现使正常的 GLRX5 表达量下降[58]. 细胞内 GLRX5 表达量的减少虽然不会干扰线粒体内[2Fe-2S]簇的正常合成,但是 GLRX5 作为[2Fe-2S]簇的转运载体,会降低[2Fe-2S]簇与脱辅基蛋白的结合,[4Fe-4S]蛋白的合成和传递至细胞质的含硫复合物也减少。 正常情况下,细胞内的铁调节蛋白 1 ( iron regulatoryprotein 1,IRP1)与 [4Fe-4S]簇结合,维持细胞内铁平衡;当 IRP1 未能结合[4Fe-4S]簇时,IRP1 就会被过度激活并与多种血红素转录因子 mRNA 的 5‘或3’非翻译区 ( untranslated regions,UTR) 结合,促进aminolevulinate δ、synthase 2(ALAS2)等血红素合成转录因子的生成[58]. 血红素主要存在于红细胞内,因此,大量铁被转运到红细胞内。 人 GLRX5 突变后出现小细胞铁粒幼细胞性贫血 ( microcyticsideroblastic anemia)[59];斑马鱼则可引起低色素性贫血 (hypochromic anemia),甚至出现胚胎致死[60].
  
  上述铁硫蛋白缺陷患者多在儿童期或少年期发病,患者一般都会出现细胞铁超载、酶活性降低、机体代谢紊乱等病症。 随着年龄的增长,病情逐渐加重,最终多死于心血管系统疾病。 这些疾病几乎都是全身性疾病,不同疾病可出现相同的临床症状和体征。 疾病的诊断和鉴别诊断主要根据临床病史、机体功能测试以及实验室检测,其中最为精确的是进行基因序列分析,但费用相对比较昂贵[61]. 目前,对于这一类疾病的治疗尚未有特异性的治疗方法,多采用抗氧化剂、灭活自由基药物、去铁剂等进行对症治疗[62].在未来基因诊断和基因治疗有望成为新的研究方向。
  
  4 问题与展望
 
  铁硫蛋白种类繁多,参与众多的生理过程,具有重要的功能。 但是其生物合成过程中,各组分之间是如何相互作用,相互调节还有待不断完善和补充。 在人类及多种模式生物中均发现,ISC 或 CIA 系统组分的异常可导致体内细胞代谢紊乱、生理功能降低、个体寿命缩短、甚至死亡。 这些提示,铁硫蛋白还可能参与到细胞应激、自噬、凋亡等多种生理过程。 随着人们对铁硫蛋白的结构、功能和生物合成研究的不断深入,将有助于揭示相关疾病发生及发展机制,为寻找新的治疗靶点提供理论基础。
 

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