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不同病理分级胶质瘤中人表皮生长因子受体-4的表达研究

更新时间:2021-01-06 09:01点击:

  张新鹃 王海凤 孙龙 姜旭光
  
  山东中医药高等专科学校西医教学部 临沂市中心医院神经外科
  
  摘    要:
  
  目的 研究不同病理级别胶质瘤中人表皮生长因子受体-4 (HER4)的表达情况。方法 选取不同病理级别胶质瘤标本88例,用免疫组织化学法和实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法分别检测HER4的表达水平。结果 HER4阳性表达主要定位于细胞质和细胞核。随着胶质瘤病理级别的升高,HER4的表达也相应增加。结论 HER4有可能在胶质瘤的发生、发展过程中发挥重要调节作用,有望成为评价胶质瘤恶性程度的重要生物学指标。
  
  关键词:
  
  胶质瘤 人表皮生长因子受体-4 病理分级
  
  人表皮生长因子受体-4 (HER4)为表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)家族的四成员之一。对于HER4在某些恶性肿瘤发生、发展过程中的作用,国内外研究很多;但HER4在胶质瘤发生、发展中作用的研究却比较少。笔者前期的研究已经证实,HER4在胶质瘤中的阳性表达率明显高于正常脑组织[1]。本实验主要采用免疫组织化学法和实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法检测HER4在不同病理级别胶质瘤中的表达情况,探讨胶质瘤的恶性程度与HER4表达之间的关系。
  
  1 资料与方法
  
  1.1 一般资料
  
  选取临沂市中心医院收治、病理科存档的胶质瘤标本88例,所有患者均初发,均以手术治疗为主,术后行放疗或化疗辅助治疗。胶质瘤标本的核查、筛选均由本院病理科经验丰富的医师进行,并根据世界卫生组织(WHO)神经系统肿瘤分类标准对肿瘤进行病理分级,分为Ⅰ~Ⅳ级。其中Ⅰ级8例,Ⅱ级25例,Ⅲ级33例,Ⅳ级22例。切除的标本组织取一部分制成4μm厚切片,备免疫组织化学法检测使用;另取一部分置于液氮-80℃保存,备实时荧光定量PCR法检测使用。
  
  1.2 主要试剂与方法
  
  1.2.1 免疫组织化学法
  
  鼠抗人HER4单克隆抗体HFR-1购自美国Abcam公司,免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。将石蜡切片常规进行脱蜡水化,以蒸馏水漂洗5 min,切片置于0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(p H 6.0)中进行高温抗原修复2 min并自然冷却25 min,冷水冲洗缸体可加快冷却。取出切片,以蒸馏水冲洗2次、每次3 min,之后用PBS液反复冲洗,共3次、每次3分钟。然后用3%浓度的H2O2浸泡10 min以阻断灭活内源性过氧化物酶,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次、每次3 min。擦干周围的PBS后用山羊血清封闭,37℃孵育约30 min。去除周围的血清后滴加一抗(稀释度为1∶200),保存在4℃冰箱过夜。按照试剂盒的使用说明进行操作(阳性乳腺癌组织作为阳性对照、PBS代替一抗作为阴性对照),PBS洗涤3次、每次5 min,擦干周围的PBS后滴加二氨基联苯氨(DAB)显色剂,清水冲洗后进行苏木素复染。蒸馏水充分冲洗,脱水,封片,光学显微镜下进行观察并拍照。
  
  以细胞质和/或细胞核中出现浅黄、棕黄、棕褐色程度不等的颗粒为HER4阳性表达。对免疫组化染色图像采用IPP 6.0图像分析软件进行半定量分析:高倍镜(×400)下随机选取每张切片的5个视野测量其积分光密度(IOD)值,即将图像上的各阳性反应点光密度相加,并测量选取区域的面积(area),然后计算光密度平均值(IOD/area)。
  
  1.2.2 实时荧光定量PCR
  
  Trizol试剂购自美国Invitrogen公司,逆转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司,引物由上海生工公司提供,引物序列见表1。Trizol法提取总RNA,测定RNA浓度、纯度和完整性;设计合成引物;按照逆转录试剂盒说明进行逆转录反应,-20℃保存;实时荧光定量PCR,并在PCR仪中运行如下程序:95℃5 min,1个循环;95℃10 s,56℃30 s,72℃30 s,40个循环。
  
  表1 HER4及GAPDH引物序列
  
  1.3 统计学方法
  
  数据记录分析采用SPSS 13.0软件。计量资料以均数±标准差表示,各病理分级胶质瘤组织中HER4表达量采用Spearman秩相关检验。
  
  2 结果
  
  2.1 免疫组织化学法检测HER4表达
  
  88例胶质瘤中HER4阳性表达54例,HER4主要在细胞质和/或细胞核阳性表达,见图1。各级胶质瘤中HER4表达的IOD/Area值见图2,胶质瘤中HER4表达与其病理分级正相关(r=0.762,P<0.05)。
  
  2.2 实时荧光定量PCR检测HER4基因相对表达量
  
  各级胶质瘤组织中HER4基因的相对表达量见图3。胶质瘤中HER4基因的相对表达量与其病理分级正相关(r=0.859,P<0.05)。
  
  3 讨论
  
  国内外关于HER4在恶性肿瘤中表达的研究并不少见,研究结果却存在差异。近年来有研究[2-5]发现,HER4在多种恶性肿瘤组织中呈过度表达,这说明HER4参与调控了多种恶性肿瘤的发生、发展。而且,国内研究[6-8]发现,HER4在结肠癌、食管鳞癌、肝内胆管癌中不仅高表达,并且与肿瘤的临床分期密切相关;与此同时,国外研究[4,9-10]也发现,HER4在原发性颅内脑膜瘤、骨肉瘤、鼻腔黏膜恶性黑色素瘤中也有高表达,并且与肿瘤的病理分级正相关。不过,在较早的一些研究中,研究者却发现了与之相反的情况。FEINMESSER等[11]较早的一项研究发现,HER4蛋白在普通痣中阳性表达率最高,在异常增生痣和黑色素瘤中的阳性表达率却逐步降低。另外一项较早的关于HER4在涎腺黏液表皮样癌中的表达及临床病理相关性的研究[12]发现,HER4在涎腺黏液表皮样癌组织中虽有高表达,但HER4的表达与病理组织学分级呈明显负相关。本次实验,笔者不论是采用免疫组织化学法还是实时荧光定量PCR法检测HER4的表达均发现:随着胶质瘤病理级别的升高,HER4的表达也相应增加,二者呈正相关。
  
  胶质瘤是人类中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,目前胶质瘤的治疗主要是以手术切除为主,结合放疗、化疗的综合治疗。胶质瘤的恶性程度不同,决定了其治疗方案及预后也大不相同。目前胶质瘤患者术前的临床诊断主要依靠影像学检查,但影像学检查却无法在术前判断其恶性程度。因此,若能在术前就判断出胶质瘤的恶性程度,将会非常有利于临床医生制定手术方案、术后放化疗措施和评估预后。
  
  综上所述,HER4在胶质瘤的恶性进展中发挥了一定的调控作用,HER4有望成为评价胶质瘤恶性程度的重要生物学指标。
  
  参考文献
  
  [1]张新鹃,王海凤,张彩坤,等.人表皮生长因子受体4在胶质瘤中的表达及生物学意义[J].2016,24(3):18-20.
  
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