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鼻疽诺卡菌NFA47650蛋白的鉴定与免疫原性研究

更新时间:2021-06-01 09:19点击:

  摘    要:目的 构建鼻疽诺卡菌NFA47650蛋白原核表达载体,诱导表达及纯化NFA47650蛋白,并分析其免疫原性。方法 根据鼻疽诺卡菌nfa-47650基因序列设计并合成引物,通过PCR扩增基因片段并构建pET30a(+)表达载体,导入BL21大肠埃希菌诱导表达并纯化。制备NFA47650小鼠抗血清,通过WesternBlot对NFA47650蛋白进行亚细胞定位和免疫原性研究。结果 成功构建鼻疽诺卡菌NFA47650蛋白的原核重组表达载体,该蛋白在BL21大肠埃希菌中以包涵体的形式高效表达。Western Blot结果显示,NFA47650蛋白主要存在于菌体培养上清中,能够被鼻疽诺卡菌抗小鼠和兔血清特异性识别。另外,该蛋白与巴西诺卡菌和盖尔森基兴诺卡菌抗小鼠血清均可发生血清交叉反应。结论 鼻疽诺卡菌NFA47650蛋白是一种分泌性蛋白,可以与不同种的诺卡菌抗血清发生免疫反应,引起免疫应答,是一种重要的免疫显性蛋白。
  
  关键词:鼻疽诺卡菌; NFA47650蛋白; 免疫原性; 亚细胞定位;
  
  Identification and immunogenicity analysis of NFA47650 protein from Nocardia farcinica
  
  Fan Shihong Ji Xingzhao Han Lichao Xu Shuai Zheng Ningwei Wang Chengling Wei Kongjiao Li Zhenjun
  
  Department of Medicine, Tibet University National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong First Medical University School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University
  
  Abstract:
  
  Objective To construct the prokaryotic expression vector of NFA47650 protein from Nocardia farcinica, induce its expression and purification,and analyze its immunogenicity. Methods Designing and synthesizing primer sbased on nfa-47650 gene sequence of Nocardia farcinica;Constructing pET30a(+) expression vector by PCR amplication;Purifying NFA47650 protein after expressing in E. coli BL21.Analyzing its subcellular localization and immunogenicity with NFA47650 mice anti-serum by Western Blot. Results The prokaryotic recombinant expression vector of Nocardia farcinica NFA47650 protein was successfully constructed, which was efficiently expressed in BL21 E. coli as inclusion bodies. Western Blot showed that NFA47650 protein was mainly located in the culture supernatant. Inaddition,this protein couldnot only be specifically identified by the antisera from mice and rabbits infected with Nocardia farcinica, but also cross-reacted with antisera from mice infected with Nocardia brasiliensis and Nocardia cyriacigeorgica. Conclusion The NFA47650 protein is an important secreted immunodominant protein, which can trigger immune response by reacting with the antisera of different Nocardiaspecies.
  
  Keyword:
  
  Nocardia farcinica; NFA47650 protein; Immunogenicity; Subcellular localization;
  
  诺卡菌(Nocardia)是一种广泛分布于土壤、腐烂植被、淡水及海水等自然环境中的微需氧型放线菌,革兰染色阳性,抗酸染色弱阳性,生长较为缓慢,在镜下可见分枝状菌丝,易与结核分枝杆菌混淆[1,2]。诺卡菌主要感染免疫功能低下或伴有合并症的患者,如艾滋病患者、糖尿病患者、器官移植或造血干细胞移植患者等,偶尔也可感染免疫功能正常的人群[3]。机体感染诺卡菌后可通过播散感染累及几乎所有器官,主要引起肺脓肿、皮肤脓肿、足菌肿,严重者甚至会引起脑脓肿[4,5],如不及时诊疗通常会危及生命[6]。据报道,诺卡菌引起中枢神经系统感染的比例约为44%[7],病死率高达34%[5]。然而,由于诺卡菌病的临床表现复杂,缺乏特异性,因此在临床上诊断难度较大,易造成漏诊及误诊。
  
  目前,对人体致病的诺卡菌约有50余种[8],其中最常见的诺卡菌为:鼻疽诺卡菌(Nocardiafarcinica)、星形诺卡菌(Nocardiaasteroides)、巴西诺卡菌(Nocardiabrasiliensis)、盖尔森基兴诺卡菌(Nocardiacyriacigeorgica)和新星诺卡菌(Nocardianova)等。鼻疽诺卡菌最早由Edmond Nocard[9]于1888年从一例牛淋巴结炎病例中分离出来。其致病力较强,主要通过带菌的灰尘经呼吸道定植于肺部而引起严重的肺部感染,严重者也会通过血液传播途径侵入脑部引起脑脓肿[10,11],且对中枢神经系统有易感性[12],是诺卡菌重要的致病菌种之一。在法国,鼻疽诺卡菌在临床上的分离率从2010年的13%,增加到2014年的27.6%[12],成为最常分离到的诺卡菌种之一[13]。在澳大利亚,鼻疽诺卡菌分离率占诺卡菌病例的14.1%[14]。在中国,统计了8家医院采集的53份诺卡菌感染临床标本,结果表明鼻疽诺卡菌检出率最高,为24.5%[15]。近年来,鼻疽诺卡菌发病率在世界各地呈现出上升的趋势,需要引起足够的重视。
  
  然而,诺卡菌的致病机制尚未阐明。越来越多的学者从过氧化氢酶、磷脂酶、侵袭素、激活炎症信号通路等方面着手,阐释了其可能的致病机制。免疫显性蛋白进入机体后,可以刺激免疫细胞活化、增殖与分化,产生特异性抗体,为疫苗研制和临床诊断提供更多的主要靶点。因此,开展对诺卡菌免疫原性蛋白研究,可能为揭示其致病性奠定重要分子基础。本课题组通过分析鼻疽诺卡菌标准菌株IFM10152基因序列,筛选出的NFA47650蛋白可能为一种免疫显性蛋白。进一步对NFA47650蛋白进行研究,可能为诺卡菌临床诊断提供应用价值,并为后续诺卡菌的致病机理提供一定的理论基础。
  
  1 材料与方法
  
  1.1 实验材料
  
  1.1.1 实验动物、菌株、质粒
  
  SPF级C57/6J雌性小鼠购买于斯贝福生物技术有限公司(北京)。动物实验已通过中国疾病预防控制中心的实验动物福利和伦理委员会审查,相关动物实验严格按照审批的实验动物伦理审查规定的实验方案进行。鼻疽诺卡菌标准菌株(Nocardiafarcinica IFM 10152)购自于德国微生物菌种保藏中心。pET30a(+)质粒由本实验室保存。
  
  1.1.2 主要试剂
  
  脑心浸液固体培养基及液体培养基均购买于英国OXOID公司;卡那霉素、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)购买于北京全式金生物技术有限公司;金牌Mix购买北京于擎科生物;His标签蛋白纯化试剂盒购于Novagen公司;佐剂购买于北京博奥龙免疫技术有限公司。
  
  1.2 实验方法
  
  1.2.1 重组质粒构建
  
  根据GenBank鼻疽诺卡菌标准菌株IFM10152基因组中的nfa-47650基因序列进行引物设计。在基因上下游分别加入酶切位点EcoRI和HindIII以及保护碱基,引物由上海生工优化并合成。经PCR扩增出目的片段切胶回收后,目的基因与pET30a(+)质粒用EcoRI和HindIII进行双酶切,纯化后连接。将连接好的质粒导入BL21大肠埃希菌感受态中,于含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB(Luria-Bertani)固体平板上筛选重组子。挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中,37 ℃振荡培养过夜,提取质粒进行聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)、双酶切以及测序鉴定重组子,保留鉴定结果正确的单克隆。
  
  1.2.2 重组蛋白的表达
  
  将序列准确的阳性重组子挑于含有卡那霉素的LB液体培养基中,37 ℃、200 r/min过夜培养,次日以1:100的比例传代,继续以相同条件培养至对数生长期,调整菌液A600值为0.8,加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2 mmol/L,0.5 mmol/L,1 mmol/L,分别在28 ℃,30 ℃,37 ℃,200 r/min条件下诱导6 h。冰浴中超声裂解,上清和沉淀进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测分析,以未诱导的大肠埃希菌为对照。
  
  1.2.3重组蛋白的纯化
  
  将培养好的重组大肠埃希菌离心,超声裂解。超声后的菌液离心(12 000 r/min,20 min,4 ℃),弃上清,留沉淀。沉淀中加入含6 mol/L尿素的1×Binding buffer重悬并过夜溶解沉淀。12 000 r/min,4 ℃离心20 min,取上清。纯化柱准备好后,用移液枪将上清移入纯化柱内,打开底端白帽,使液体流尽。用不同浓度的含6 mol/L尿素的咪唑洗涤缓冲液(20 mmol/L咪唑缓冲液、40 mmol/L咪唑缓冲液、60 mmol/L咪唑缓冲液、100 mmol/L咪唑缓冲液和250 mmol/L咪唑缓冲液)去除杂蛋白,收集目的蛋白(每个洗脱液都进行收集),进行SDS-PAGE检测分析,确定最佳洗脱条件。并将纯度高的蛋白收集至一个离心管中,置于4 ℃备用。将上述纯化好的目的蛋白放入透析袋中,将透析袋放入含不同浓度尿素的透析液(4 mol/L尿素透析液、2 mol/L尿素透析液、0 mol/L尿素透析液)中进行蛋白的复性。(透析全过程在4 ℃条件下进行)。磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution,PBS)置换和二辛可宁酸法(bicinchoninic acid method,BCA)测定蛋白浓度后,分装,置于-80 ℃保存。
  
  1.2.4重组蛋白抗血清制备
  
  每只小鼠免疫量为50 μL(10 μg);无菌条件下取出佐剂50 μL与蛋白样品1:1快速混匀,并快速注射入小鼠后腿肌肉层;第21天以同样方式加强免疫一次;第35天后,通过眼球采血,室温静置1 h后于4 ℃保存5~6 h,待血液凝固血块回缩后4 000 r/min离心10 min,取上清进行血清效价测定。
  
  1.2.5 重组蛋白免疫原性研究
  
  纯化后的蛋白进行SDS-PAGE,在15 V电压下半干转1 h将蛋白转至聚偏二氟乙烯膜(Polyvinylidene fluoride membrane,PVDF)。用5%脱脂奶粉的TBST溶液于室温摇床孵育2h,TBST洗3次,每次10 min。分别以下列抗血清作为一抗:抗鼻疽诺卡菌全菌小鼠抗血清(1:3 000)、抗鼻疽诺卡菌全菌兔抗血清(1:3 000)、抗巴西诺卡菌全菌小鼠抗血清(1:4 000)、抗盖尔森基兴诺卡菌全菌小鼠抗血清(1:4 000)、Anti-His(1:4 000)、对照组小鼠抗血清(1:4 000),对照组兔抗血清(1:4 000)。置于4℃封闭过夜。封闭后的PVDF膜再次用TBST洗3次。用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记山羊抗鼠IgG(1:5 000)和HRP标记山羊抗兔IgG(1:4000)作为二抗室温摇床孵育1 h,TBST洗3次后显色。
  
  1.2.6 蛋白亚细胞定位
  
  鼻疽诺卡菌亚细胞成分分离。细菌分泌蛋白:培养好的鼻疽诺卡菌离心取上清,然后向上清液中加入甲醇、氯仿。滤液:甲醇:氯仿为4:4:1,充分混匀后,4 ℃条件下,15 000 r/min离心5 min,弃上清,再向沉淀加入前一步相同体积的甲醇,混匀后,4 ℃条件,13 000 r/min离心5 min,弃上清后再重复操作一次,最后弃上清,离心管于室温下干燥5~10 min,用适量无菌PBS溶解沉淀,所得蛋白即为菌体分泌蛋白;第一步离心留下的菌体用PBS洗涤3次后,用PBS重悬,加入适量蛋白酶抑制剂,通过超声裂解菌体(裂解过程全程在冰上操作),裂解后的菌液留样为全菌蛋白,剩余样本首先在5 000 g离心50 min,弃上清,然后离心(27 000 g,4 ℃)1 h,所得沉淀即为诺卡菌细胞壁成分,上清 为诺卡菌胞质和胞膜成分。对上述亚细胞成分通过BCA测定蛋白浓度后,将相同质量(4 μg)的上述细胞成分进行SDS-PAGE和Western Blot分析,一抗应用抗蛋白小鼠血清,稀释比例为1:4 000。
  
  2 结果
  
  2.1 鼻疽诺卡菌NFA47650基因扩增
  
  通过PCR扩增目的片段,进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析,结果如图1所示,泳道1出现特异性条带,并且目的基因片段符合预期大小。
  
  图1 NFA47650电泳结果
  
  2.2 重组质粒pET30a-47650鉴定
  
  在过夜培养的重组大肠埃希菌BL21中提取pET30a-47650重组质粒,经过限制性内切酶EcoR I和Hind III进行双酶切,进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析(图2),目的基因以及质粒大小符合预期,重组质粒送公司测序,通过序列比对,没有出现突变,与目的基因序列一致,表明重组质粒构建成功。
  
  图2 pET30a-47650重组质粒双酶切结果
  
  2.3 重组蛋白NFA47650的表达鉴定
  
  在不同浓度IPIG诱导剂及不同温度条件下摸索NFA47650蛋白最佳表达条件。冰浴中超声裂解全菌得到上清和沉淀,对蛋白样品进行SDS-PAGE(图3)。结果表明NFA47650蛋白在37 ℃,0.2 mmol/L IPTG终浓度条件下诱导最佳,蛋白表达量最高;蛋白以包涵体形式存在,且纯化后的蛋白条带单一(图4)。
  
  图3 SDS-PAGE分析NFA47650蛋白表达情况
  
  图4 纯化后的NFA47650蛋白
  
  2.4 重组蛋白NFA47650蛋白浓度测定
  
  采用BCA法测定NFA47650蛋白浓度(图5)。将吸光度值代入线性公式y = 1008.x - 118.8(R² = 0.998),得出NFA47650蛋白浓度为760 μg/mL。
  
  图5 纯化后的NFA47650蛋白测定的标准曲线
  
  2.5 重组蛋白NFA47650免疫原性研究
  
  为了研究NFA47650蛋白的免疫原性,本课题组通过免疫动物,制备了兔和鼠的鼻疽诺卡菌抗菌血清,以及巴西诺卡菌全菌小鼠抗血清和盖尔森基兴全菌小鼠抗血清。NFA47650蛋白可被抗HIS标签抗体所识别,另外鼻疽诺卡菌抗兔和抗鼠血清能够特异性的识别重组NFA47650蛋白,而空白小鼠和兔血清不能识别。此外,NFA47650蛋白还能被盖尔森基兴诺卡菌和巴西诺卡菌抗血清所识别(图6)。
  
  图6 Western Blot分析鼻疽诺卡菌NFA47650蛋白免疫原性
  
  2.6 NFA47650蛋白亚细胞定位
  
  实验室通过制备NFA47650蛋白的小鼠抗血清,免疫小鼠后发现,NFA47650蛋白能够刺激机体产生高效价的抗血清,能特异性的识别NFA47650蛋白,而空白小鼠血清不能识别(图7)。为了确定NFA47650蛋白在鼻疽诺卡菌中的位置,通过物理方法分离得到鼻疽诺卡菌的各亚细胞成分,通过Western Blot方法,结果显示,NFA47650蛋白主要存在培养上清中,在胞质和胞膜以及细胞壁中少量存在(图8)。
  
  图7 Western Blot验证NFA47650蛋白与抗血清的反应性
  
  图8 Western Blot分析鼻疽诺卡菌NFA47650蛋白亚细胞定位
  
  3. 讨论
  
  鼻疽诺卡菌作为一种条件致病菌,其定植、侵袭及致病毒力因子尚不明确。从蛋白角度研究诺卡菌有助于进一步阐释其致病机制。研究发现,盖尔森基兴诺卡菌HBHA蛋白具有黏附作用,在诺卡菌感染器官定植过程中可能具有重要作用;鼻疽诺卡菌34810蛋白具有侵袭功能,并能通过Toll样受体(Toll-like receptor 4,TLR4)激活固有免疫信号通路,特异性的刺激TNF-α的上调,调节固有免疫反应;鼻疽诺卡菌Mce1E蛋白在侵袭宿主细胞中发挥了重要的作用[16,17,18]。
  
  本研究成功构建了鼻疽诺卡菌NFA47650蛋白的原核表达载体,获得了浓度较高的NFA47650重组蛋白。通过制备不同种动物血清对鼻疽诺卡菌NFA47650蛋白免疫原性验证,发现该蛋白能被鼻疽诺卡菌抗兔和抗鼠血清特异性识别,提示该蛋白是一种免疫显性蛋白,在小鼠感染过程中可以高效表达,并诱导机体产生特异性抗体,参与其体液免疫。另外,巴西诺卡菌和盖尔森基兴诺卡菌也是导致人体感染常见的诺卡菌菌株,因此本次试验制备了巴西诺卡菌全菌小鼠抗血清和盖尔森基兴全菌小鼠抗血清。通过Western Blot分析,鼻疽诺卡菌NFA47650蛋白能够被巴西诺卡菌和盖尔森诺卡菌抗血清所识别,说明该蛋白可以与巴西诺卡菌和盖尔森基兴诺卡菌抗菌血清存在免疫交叉性,可以与不同种的诺卡菌抗菌血清发生免交叉反应,进一步说明该蛋白是一种重要的免疫显性蛋白。
  
  蛋白质只有处在合适的亚细胞位置才能发挥其作用,因此蛋白的亚细胞定位具有十分重要的意义。通过制备鼻疽诺卡菌NFA47650蛋白抗血清与分离鼻疽诺卡菌各亚细胞成分进行分析,结果表明鼻疽诺卡菌NFA47650蛋白是一种分泌蛋白,通过分泌到胞外发挥作用。
  
  综上,本研究发现了一种鼻疽诺卡菌的免疫显性蛋白NFA47650,并对其进行了一个基本研究,发现NFA47650蛋白在感染过程中能刺激机体产生特异性抗体,是一种重要的免疫显性蛋白。本研究仍存在不足之处,只对其进行了初步的探索,后续将对NFA47650蛋白进行更深入的研究,分析该蛋白的应用价值,探究其如何调控固有免疫信号通路,从而调节固有免疫反应,为后续研究诺卡菌致病机制提供一定的理论价值以及在诺卡菌免疫学诊断过程中提供可能的临床应用价值。

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