27医学论文范文网

主页
分享医学论文范文

胃幽门螺杆菌感染后semaphorin 5A和TGF-β1的表达及其相关性研究

更新时间:2021-07-22 08:42点击:

  摘    要:目的 观察幽门螺杆菌(Hp)感染对胃粘膜semaphorin 5A和TGF-β1表达的影响,及其介导人胃癌发生的潜在作用研究。方法 收集临床胃腺癌蜡块100例,经Giemsa确认感染Hp,分为是否感染2组。再采用免疫组织化学法检测semaphorin 5A和TGF-β1的表达,并分析semaphorin 5A及TGF-β1之间表达的相关性。另外,建立Hp国际标准株ATCC26695感染SD大鼠动物的模型,并且设立以3个月为时间节点的实验组,以不加Hp的PBS作为对照组。采用HE,Giemsa和W-S观察胃粘膜及Hp的形态,应用荧光定量PCR、蛋白免疫印迹测定胃粘膜semaphorin 5A和TGF-β1的表达。结果 Hp阳性胃腺癌组织内semaphorin 5A和TGF-β1表达显著高于Hp阴性组,semaphorin 5A和TGF-β1呈正相关(P<0.05)。Hp感染组大鼠胃粘膜semaphorin 5A和TGF-β1的mRNA和蛋白表达显著高于未感染组。结论 Hp感染可导致胃粘膜semaphorin 5A和TGF-β1的表达增加,且两者存在显著正相关,Hp感染可能通过促semaphorin 5A、TGF-β1表达介导胃癌发生。
  
  关键词:幽门螺杆菌 胃癌 Semaphorin 5A TGF-β1 大鼠
  
  Study on the Correlation Between the Expression Levels of Semaphorin 5A and TGF-β1 in Gastric Tissues with Helicobacter Pylori infection
  
  LI Geng HE Ying PAN Guoqing
  
  The First Affiliated hospital of Kunming Medical College;
  
  Abstract:Objective To observe the expression of semaphorin 5 A and TGF-β1 in Helicobacter pylori(Hp)-infected and mediated the potential interaction in human gastric adenocarcinoma(GAC).Methods 100 paraffin-embedded human GAC samples were selected, Hp infection was detected by Giemsa staining, and were divided into 2 groups.Immunohistochemical staining was used to detect the expression of semaphorin 5 A and TGF-β,and analyze the correlation between the expression of semaphorin 5 A and TGF-β1.In addition, Hp standard strain ATCC26695 with intragastric administration was used to establish the SD rat model of Helicobacter pylori gastritis, and intragastric administration for the time point(3 months),PBS was given to the rats in the control group in the same way.The morphology of gastric mucosa and HP were observed by HE,Giemsa and W-S staining.The mRNA and protein expressions of semaphorin 5 A and TGF-β1 in gastric mucosa were detected by RT-qPCR,WB.Results Overexpression of semaphorin 5 A and TGF-β1 were seen in Hp+ GAC group(P<0.05).The expression level of semaphorin 5 A was positively correlated with TGF-β1.Compared with the control group, the mRNA and protein levels of semaphorin 5 A and TGF-β1 in gastric mucosa of the Hp infected group were significantly higher than those in the PBS group(P<0.05).Conclusion Semaphorin 5 A and TGF-β1 are all up-regulated in the gastric infection by Hp.Meanwhile, the expression level of semaphorin 5 A is positively correlated with TGF-β1,Hp can promote gene semaphorin 5 A and TGF-β1 expression to mediate gastric cancer.
  
  Keyword:Helicobacter pylori; Gastric cancer; Semaphorin 5A; TGF-β1; Rats;
  
  幽门螺旋杆菌(helicobacter pylori, Hp)感染是我国人群最常见的细菌病原体之一,最新报告显示国人感染率高达55%左右[1]。Hp作为启动子通过胃粘膜定植并形成胃粘膜相关病变,根据Correa级联反应[2],病变逐渐发展为胃癌,这一过程伴随着基因失活与激活机制的改变[3]。近年来,人类对胃癌精准性与靶向治疗的需求与日俱增,而其理论及构想必然基于胃癌相关的基因的研究。基因信号素5A(semaphorin 5A)和转化生长因子β1(TGF-β1)在胃癌及癌前病变中已有多次报道[4-6],然而Hp对semaphorin 5A、TGF-β1的影响尚未完全明确,因此本文就Hp感染状态下的实验动物及人胃腺癌组织中semaphorin 5A和TGF-β1表达情况做一初步研究,为Hp介导胃癌发生、发展机制研究提供一定前期基础。
  
  1 材料与方法
  
  1.1 主要试剂及仪器
  
  小苏打,Giemsa及W-S银染液购于Solarbio公司;一抗semaphorin 5A、TGF-β1及β-actin抗体分别购于美国RD,Abcam, Sigma公司;ABI-7500实时荧光定量PCR仪购于美国ABI公司;试剂盒活性检测购于上海Beyotime生物工程有限公司,Real-time PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司;转膜仪及SDS-PAGE电泳设备购于美国Bio-rad公司;PVDF膜、ECL超敏发光液购自德国Merck公司等。
  
  1.2 幽门螺杆菌的培养
  
  于-80 ℃冰箱取出ATCC26695菌株,水浴复苏,种植于含5%无菌脱纤维羊血的哥伦比亚琼脂培养基,放入微需氧培养罐中置于37 ℃培养箱培养。培养基经高压灭菌后自然冷却至50 ℃时添加脱纤维羊血及多粘菌素B,万古霉素,两性霉素,TMP混匀后浇板。将菌落形态的Hp悬浮于PBS中,测定OD660,1OD660=1×108菌落形成单位(CFU)。
  
  1.3 模型鼠制备及分组
  
  30只SPF级SD大鼠,6~ 8周龄,雌雄各半体质量180~ 200 g, 由南京医科大学实验动物中心提供(合格证:NO.201917016)。大鼠随机分为对照组、感染组,每组各15只。均在SPF级动物实验室干湿适宜条件下,雌雄分开,分笼饲养。循环昼夜光照间隔12 h切换,室内温度为20 ℃ ~ 24 ℃。感染组大鼠每只用胃管喂以5%NaHCO3 2ml灌胃,半小时后用Hp培养细菌悬液4 ml进行灌胃(5×108CFU/ml),对照组灌胃等剂量PBS。每周感染大鼠2次,共8次,Hp末次灌胃结束后,分别继续常规饲料饲养3个月。
  
  1.4 标本处理及Hp检测
  
  大鼠麻醉固定后,快速取出全胃,沿胃大弯剪开,用冷生理盐水冲洗后,一分为二,分别于多聚甲醛固定和-80 ℃保存备用待测。分别于最后一次灌胃3月后取材,进行造模成功指标检测。胃黏膜石蜡Giemsa及W-S染色检查检测出Hp, 均阳性说明造模成功。
  
  1.5 RT-qPCR法检测组织中semaphorin 5A,TGF-β1的mRNA表达情况
  
  胃组织中总RNA提取及cDNA合成:参照Trizol提取胃组织的总RNA,在nanodrop-2000上测260 nm/280 nm比值达到1.8至2.0后,按逆转录试剂盒操作方法得到cDNA。引物设计结果见表1。实时荧光定量RT-qPCR扩增程序用荧光定量检测试剂盒,在Bio-Rad荧光定量PCR仪上扩增。扩增条件:95 ℃预变性10 min, 95 ℃变性15 s, 60 ℃延伸60 s, 40个循环。分析结果,得出各组内参基因和目的基因Ct值,运用2-△△Ct公式计算。
  
  表1 引物序列
  
  1.6 免疫印迹检测组织中semaphorin 5A和TGF-β1的蛋白表达情况
  
  选取Hp感染组及对照组大鼠胃组织加RIPA裂解液冰上裂解,提取组织总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。加入样品缓冲液后沸水浴变性,离心后上样,电泳分离,转印,5%脱脂奶粉封闭,加入抗semaphorin 5A、TGF-β1及β-actin抗体后4 ℃过夜。一抗孵育结束后,洗膜,二抗室温孵育1 h, 洗膜后入ECL发光,凝胶成像分析曝光数据,上Image-J图像,计算灰度值。
  
  1.7 胃癌标本收集及免疫组织化学检测组织中semaphorin5A和TGF-β1的蛋白表达情况
  
  收集本院2018至2019年胃癌切除术后诊断为胃腺癌石蜡组织100例,所有患者手术前未经过放化疗并有幽门螺杆菌感染病史。收集的蜡块切片脱蜡至水,EDTA抗原修复,过氧化氢消除内源性酶,分别加入同WB的一抗和二抗,DAB显色,苏木精复染。免疫组化结果判定:通过评分SEMA5A和TGF-β1染色阳性百分率和染色强度来确定表达水平。随机选取组织中3个区域,共300个细胞,计数免疫阳性细胞数,得分为0.1(阳性细胞的 1%~10%),0.2(阳性细胞的 11%~20%),和 0.3(20%~30%的细胞呈阳性),依此类推。此外,强度被指定为弱(1分),中(2 分),强(3 分)或非常强(4分)。通过将阳性细胞的范围乘以强度来计算 IHC 综合评分。
  
  1.8 统计学分析
  
  所有数据以均数±标准差(x¯±s)表示,两组间差异性比较用独立样本t检验,两因子相关性比较采用Pearson或Spearman分析,P<0.05为有统计学意义。
  
  2 结果
  
  2.1 大鼠 Hp定值及组织HE炎症结果
  
  首先收集感染大鼠胃组织样本,再通过Giemsa染色及W-S银染显示胃粘膜可见Hp定植。镜下Giemsa染色背景为蓝色,Hp为深蓝色杆状。W-S银染背景为棕黄色,Hp呈黑色杆状。随着灌胃时间的延长,胃粘膜表面Hp也逐渐增多。
  
  HE染色显示:感染组大鼠多量胃粘膜上皮脱落及坏死样物,随之感染时间延长,胃黏膜炎症细胞也随之出现,主要为淋巴细胞,部分可达粘膜下层。而对照组镜下未见明显炎症改变。
  
  2.2 Hp感染对大鼠胃黏膜semaphorin 5A,TGF-β1mRNA表达的影响
  
  如图1所示,随着Hp感染3个月后,semaphorin 5A及TGF-β1的mRNA表达水平较对照组表达均有上升(P<0.01),见表2。
  
  图1 各组胃粘膜中semaphorin 5A,TGF-β1 mRNA表达情况
  
  表2 各组胃组织中semaphorin 5A和TGF-β1 mRNA表达水平比较(x¯±s)
  
  2.3 Hp感染对大鼠胃黏膜semaphorin 5A,TGF-β1蛋白表达的影响
  
  WB结果显示和PCR结果一致,即Hp感染后能够明显上调semaphorin 5A、TGF-β1在胃粘膜内的表达。图2的B-C为semaphorin 5A和TGF-β1与β-actin的相对灰度值。
  
  图2 各组胃组织中semaphorin 5A,TGF-β1蛋白表达情况
  
  2.4 Hp感染对人胃腺癌semaphorin 5A,TGF-β1表达的影响
  
  选取100例胃腺癌组织经Giemsa染色结果显示,100例胃癌中有54例为Hp+,46例为Hp-。 Hp阳性的胃腺癌组织,其中放大的癌旁腺体内见Hp; semaphorin 5A和 TGF-β1在Hp阳性胃癌腺体的细胞膜或质中呈强阳性反应;而在Hp阴性胃癌腺体的细胞质中呈中度阳性反应。二种蛋白免疫组化评分在Hp+组均高于Hp-组,P分别为0.002,0.007,均小于0.01。在Hp+后胃腺癌中semaphorin 5A表达与TGF-β1表达呈正相关(γ=0.762,P=0.001),见表3。
  
  表3 Hp+组和Hp-组semaphorin 5A、TGF-β1表达的差异(x¯±s)
  
  3 讨论
  
  胃癌的发生是1种多过程、多阶段疾病,幽门螺杆菌作为胃癌I类致癌原,约90%非贲门部胃癌的发生与Hp感染相关。Hp作为诱发胃癌的始动因素,利用毒力因子,通过Ⅳ型分泌系统(T4SS)使其在胃粘膜上皮内粘附引起宿主免疫应答,细胞增殖凋亡失衡,癌基因和抑癌基因的表达改变,最终导致胃癌[7-8]。然而,Hp感染具体调控细胞增殖凋亡失衡的分子机制有待进一步明确。有研究显示,semaphorin 5A与细胞增殖、凋亡过程有关[9]。课题组前期研究发现,Hp感染后的GES-1细胞中,semaphorin 5A表达上调。有趣的是,该研究同时发现,胃癌细胞中,semaphorin 5A亦呈高表达。
  
  Semaphorin 5A,是semaphorins家族5类中的成员。Semaphorins又称为轴突导向分子,即在神经系统发育过程中引导轴突到达靶位点。后来发现其可以调节多种生理过程,包括胚胎心血管发育和免疫系统调节,更为重要的是发现在多种癌症中有异常表达,并且与癌症相关的肿瘤脉管形成和癌细胞转移有很大的关联性[10]。现阶段多项研究表明,semaphorin 5A作为1种胃癌相关基因,能够在胃癌中高表达并且可以调控癌细胞的生物学活性[11-12]。有报道指出semaphorin 5A和TGF-β1在结构上存在相同的结构域TSP-1(血小板反应素)[13],而TSP-1恰恰是活化TGF-β1的关键。在此理论基础上潘[14]利用RNAi技术在胃癌细胞实验上显示semaphorin 5A可以激活TGF-β1,证实TGF-β1为其下游信号分子。
  
  现阶段研究表明TGF-β1在胃癌晚期起促进作用,包括肿瘤新生脉管形成、细胞黏附性降低、免疫抑制等效应[15]。该效应与semaphorin 5A在肿瘤中的生物学功能具有高度一致性。在本次实验中,我们也发现Hp感染后TGF-β1的表达量明显上升,具有统计学意义,与其他同类型的Hp相关性实验相一致。如马等[16]通过观察临床患者外周血清显示慢性活动性胃炎伴Hp阳性患者、TGF-β1水平高于阴性对照组,胃粘膜严重程度同样升高。柳等[17]研究也显示TGF-β1蛋白在Hp+胃癌石蜡标本中表达量更高。据此,我们推测,Hp感染后TGF-β1作为semaphorin 5A下游信号分子影响胃癌发病过程。
  
  基于以上假设,我们参照史等[18]的方法构建体内动物模型,经检测,模型符合洛桑会议幽门螺杆菌感染标准[19]。进一步结果显示,随着Hp感染时间的延长,semaphorin 5A表达量要显著高于对照组(P<0.01),胃癌石蜡样本中同样Hp+组要显著高于对照组(P<0.01),提示Hp能够引起上调胃粘膜semaphorin 5A表达。这与先前我们在胃癌前病变,包括人GES-1细胞与Hp共培养的体外实验均证明Hp感染能够上调semaphorin 5A表达量相一致[5,20]。通过观察动物实验时间节点发现semaphorin 5A与TGF-β1表达量与Hp感染呈正相关,随着时间延长炎症严重程度也在加重,也符合Hp感染相关性胃炎的病理生理学改变。同时,本实验分析胃癌组织在蛋白水平的semaphorin 5A与TGF-β1表达的相关性发现,semaphorin 5A与TGF-β1呈正相关,提示Hp可能协同semaphorin 5A与TGF-β1在胃癌中进程发展,进一步证实了我们假设。
  
  当然,本研究中仍然存在诸多不足。首先,由于时间限制,我们的动物模型尚未出现癌前病变的特征性表现;其次TGF-β1表达的上调是由于Hp感染直接引起,还是由于semaphorin 5A的表达升高,进而激活相关信号通路间接引起,还有待进一步探讨;最后,Hp感染后引起semaphorin 5A/TGF-β1信号轴的下游分子通路有待进一步明确。
  
  综上所述,我们使用在时间点(3月)获得Hp感染大鼠模型,并分析得出semaphorin 5A和TGF-β1在大鼠及人Hp相关性胃粘膜病变中的表达上调,且在胃癌组织两者表达具有正相关性。可进一步证实Hp诱导胃粘膜相关病变的发生,其机制可能与Hp激活semaphorin 5A/ TGF-β1信号通路有关。据此,我们可以初步认为,Hp感染可能通过semaphorin 5A/TGF-β1信号轴介导胃癌发生。
  
  参考文献
  
  [1] 胡奕,吕农华.我国幽门螺杆菌感染防治中面临的问题与对策[J].现代消化及介入诊疗,2019,24(3):219-221,218.
  
  [2] Correa P,Piazuelo MB,Wilson KT.Pathology of gastric intestinal metaplasia:clinical implications[J].Am J Gastroenterol,2010,105 (3) :493-498.
  
  [3] 李晓楠,张雷.胃癌相关基因与幽门螺旋杆菌感染关系的研究进展[J].医学研究与教育,2017,34(3):48-55.
  
  [4] 许旭,杨淑霞,詹艳梅,et al.semaphorin5A在胃癌中的表达及临床意义[J].中国妇幼健康研究,2017,28(S1):84-85.
  
  [5] Pan G,Su G,Wang Y,et al.Effect of Helicobacter pylori on the expression of semaphorin 5A in patients with gastric precancerous lesions and its clinical significance[J].Int J Clin Exp Pathol,2017,10(2):1403-1409.
  
  [6] Luo J,Chen X,Li P.The Role of TGF-β and Its Receptors in Gastrointestinal Cancers[J].Transl Oncol,2019,12(3):475-484.
  
  [7] 国家消化系疾病临床医学研究中心(上海),国家消化道早癌防治中心联盟(GECA),中华医学会消化病学分会幽门螺杆菌学组,等.中国幽门螺杆菌根除与胃癌防控的专家共识意见(2019年,上海)[J].中华消化杂志,39(5):310-316.
  
  [8] Malfertheiner P.Helicobacter pylori Treatment for Gastric Cancer Prevention[J].New Engl J Med,2018,378(12):1154-1156.
  
  [9] 龚琳,潘国庆.神经导向分子SEMA5A的研究进展[J].重庆医学,2020,49(15):2566-2571.
  
  [10] Gurrapu S,Tamagnone L.Semaphorins as Regulators of Phenotypic Plasticity and Functional Reprogramming of Cancer Cells[J].Trends Mol Med,2019,25(4):303-314.
  
  [11] Pan GQ,Ren HZ,Zhang SF,et al.Expression of semaphorin 5A and its receptor plexin B3 contributes to invasion and metastasis of gastric carcinoma[J].World J Gastroenterol,2009,15(22):2800- 2804.
  
  [12] Pan G,Zhang X,Ren J,et al.Semaphorin 5A,an Axon Guidance Molecule,Enhances the Invasion and Metastasis of Human Gastric Cancer through Activation of MMP9[J].Pathol Oncol Res,2013,19(1):11-18.
  
  [13] Adams RH,Betz H,Andreas W.Püschel.A novel class of murine semaphorins with homology to thrombospondin is differentially expressed during early embryogenesis[J].Mech Dev,1996,57(1):33-45.
  
  [14] 潘国庆.神经轴突导向分子Semaphorin 5A在人胃癌中表达、作用及其分子机制的研究[D].中南大学,2010.
  
  [15] Li N,Xie C,Lu N.Transforming growth factor-β:an important mediator in Helicobacter pylori-associated pathogenesis[J].Front Cell Infect Microbiol,2015,5:77.
  
  [16] 马健,孟欣颖,王涛,等.慢性活动性胃炎患者血清IL-6、TGF-β1及IL-17的水平与幽门螺杆菌的关系及临床意义[J].中华临床医师杂志(电子版),2012,6(11):2908-2910.
  
  [17] 柳兴源,孟海.HP感染后TGF-β1及NF-κB蛋白在胃癌组织中的表达[J].辽宁医学院学报,2014,35(4):3-6.
  
  [18] 史冬梅,侯艳玲,林亚平,等.SD大鼠H.pylori感染胃炎模型的建立[J].胃肠病学和肝病学杂志,2013,22(5):431-433.
  
  [19] 刘文忠.幽门螺杆菌研究进展[M].上海科学技术文献出版社,2001.
  
  [20] 刘涛,李睿,龚琳,等.胃幽门螺杆菌感染后Semaphorin 5A致胃癌可能机制的研究[J].分子诊断与治疗杂志,2019,11(3):189-193.

推荐文章

在线客服