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炎性调控中降钙素基因相关肽的功能分析

更新时间:2020-03-16 10:50点击:

  摘要:目的探讨降钙素基因相关肽(CGRP)在炎性调控中的作用,验证CGRP可通过活性氧簇-核苷酸结合低聚体结构域样受体3(ROS-NLRP3)信号通路抑制小鼠巨噬细胞炎性因子的分泌。方法实验分为对照组、脂多糖(LPS)100ng/ml组(LPS组)、CGRP10ng/ml组(CGRP10组)、CGPR30ng/ml组(CGRP30组)、CGRP100ng/ml组(CGRP100组)和CGRP30ng/ml+LPS100ng/ml组(CGRP30+LPS组),作用12h后,分别收集各组细胞的培养上清,免疫酶联吸附法(ELISA)检测上清液中白介素-1β(IL-1β和)肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的蛋白表达。同时收集各组细胞,荧光定量反转录聚合酶连锁反应(qRT-PCR)检测炎症因子IL-1β、TNF-α和炎性复合体NLRP3mRNA的表达水平。流式细胞术检测各组细胞内ROS水平,免疫印迹法检测ROS-NLRP3信号通路相关蛋白NLRP3、caspase-1、IL-1β和TNF-α的表达。结果与对照组相比,LPS组细胞中IL-1β、TNF-α和NLRP3的mRNA表达水平增加,培养上清中IL-1β和TNF-α的蛋白表达水平增加,细胞内ROS水平增加,且细胞内NLRP3、caspase-1、IL-1β和TNF-α的蛋白表达水平也增加;与LPS组相比,CGRP10组、CGRP30组、CGRP100组、CGRP30+LPS组细胞中IL-1β、TNF-α和NLRP3的mRNA表达水平降低,培养上清中IL-1β和TNF-α的蛋白表达水平降低,细胞内ROS水平降低,且细胞内NLRP3、caspase-1、IL-1β和TNF-α的蛋白表达水平也降低,且所有指标中CGRP30组降低最明显。结论CGRP可降低巨噬细胞内ROS和NLRP3的表达,使炎性因子IL-1β和TNF-α的释放减少,CGRP可能在降低局部炎症反应中发挥重要的调控作用。
 
  关键词:CGRP;ROS-NLRP3;小鼠;巨噬细胞;炎性因子;
 
  降钙素基因相关肽(Calcitoningenerelatedpeptide,CGRP)是由感觉神经元释放的一种肽类物质,[1]。已有研究证实CGRP具有显着的抗炎效果[2,3],通过抑制T淋巴细胞的增殖,抑制巨噬细胞产生促炎因子,调节炎症反应[4]。核苷酸结合低聚体结构域样受体3(Nucleotidesbindingoligomerdomainlikereceptors3,NLRP3)作为炎症反应中的炎症小体[5],主要在外周单核巨噬细胞和脑内小胶质细胞中表达[6]。活性氧簇(Reactiveoxygenspecies,ROS)被认为是最重要的激活炎症小体NLRP3的因素[7,8]。NLRP3炎症小体在ROS激活后能够活化半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1),使炎症因子成熟并释放到胞外以发挥作用[9]。因此,我们推测CGRP可能作为调控者通过ROS使NLRP3活性降低,从而降低局部炎症反应。基于此,本研究对该推测进行验证。
 
  1材料与方法
 
  1.1实验试剂及仪器
 
  大肠杆菌0111:B4的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(美国Sigma公司),CGRP(南京肽业生物科技有限公司),兔抗NLRP3、caspase-1、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α)抗体(美国Santa公司),辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(武汉博士德生物科技有限公司),Trizol试剂(美国Invitrogen公司),TaqMan逆转录试剂盒(美国LifeTechnologies公司),小鼠源性IL-1β和TNF-α的免疫酶联吸附法(Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)检测试剂盒(美国EXCEL公司),荧光定量反转录聚合酶连锁反应(Quantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction,qRT-PCR)试剂盒(美国GeneCopoeia公司),BioRadIQTM5Multicolor实时荧光定量系统(美国BioRad公司),紫外可见分光光度计(美国Thermo公司,型号Nanodrop2000),MultiskanMK3酶标仪(美国Thermo),FACSCantoII流式细胞仪(美国BD),奥林巴斯荧光倒置显微镜OlympusIX71(日本Nikon公司,Image-ProPlus7.0成像系统)。
 
  1.2细胞培养及处理方法
 
  RAW264.7巨噬细胞(中国科学院上海细胞库,上海),所用培养液为含10%FBS(杭州四季青生物材料有限公司)、含100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的双抗的α-MEM培养基(美国Gibco公司),于37℃、5%CO2孵箱中常规培养。当细胞生长至汇合度为80%-90%时换一次液,此时显微镜下观察到巨噬细胞生长形态正常,呈梭形,半贴壁生长,见图1。实验分为对照组、对照组、LPS100ng/mL组(LPS组)、CGRP10ng/ml组(CGRP10组)、CGPR30ng/ml组(CGRP30组)、CGRP100ng/ml(CGRP100组)和CGRP30ng/ml+LPS组(CGRP30+LPS组),加LPS或CGRP处理前将FBS含量降至0.5%。每组设3个平行样,并重复3次。RAW264.7细胞以5×104个/ml,接种于10cm细胞培养皿中(总体积为10mL),孵育24h,经LPS和CGRP刺激后,收集细胞及培养上清用于后续实验。
 
  1.3RNA提取和qRT-PCR检测
 
  各加100μl的TRIzol裂解液到六孔板中,常温静置后加入氯仿140ml,剧烈摇晃15s,低温离心15min,离心速度12000r/min。取上层液体置于干净EP管中,加入异丙醇,混匀后室温放置10min。继以转速7500r/min,4℃离心5min去上清。采用1ml75%乙醇洗涤沉淀,干燥后溶于30μl无酶水,检测RNA浓度,剩余RNA放入冰箱保存备用。采用紫外可见分光光度计测定A260/A280比值,当比值在1.8~2.0之间时表示所提取的RNA可用于后续实验。以提取的细胞总RNA为模板,逆转录生成cDNA,以cDNA为模板,根据基因数据库应用引物表达-2软件设计引物序列,CGRP(M34090)为前引物:5′-GAGGCAGCTACAAGGTTCAGG-3′,后引物:5′-AG-GTGTTGGTGCTGGACACA-3′。管家基因GAP-DH作内对照,前引物:5′-GGCCTTCCGTGTC-CTACC-3′,后引物:5′-CGGCATGTCAGATCCACAAC-3′)。PCR反应体系10μL,开始50℃3min,然后95℃10s、60℃30s、72℃30s循环40次,反应结束后采用分离曲线法确定反应产物的特异性。实验数据分析采用实时定量PCR循环阈值CT(cyclethreshold,CT)比较法,以管家基因GAPDH的CT为内对照,mRNA相对表达量为同一个样本CGRP-mRNA的CT值与GAPDH-mRNA的CT值之比。经实时荧光定量系统检测并记录实验结果。所有引物均由Invitrogen公司合成,其中GAPDH为内参,2-ΔΔCT用于计算相对表达量,ΔΔCT=(CTgene-CTGAPDH)target-(CTgene-CTGAPDH)control。每个样品设置三个复孔,反应体系为20μl。
 
  1.4ELISA实验
 
  收集细胞培养上清,上清液中IL-1β和TNF-α的表达根据ELISA检测试剂盒的说明书进行检测。按说明书的要求准备样品并将其加入试剂盒配套的96孔板中,随后加IL-1β和TNF-α抗体孵育。用洗涤液洗净,加显色底物及酶结合工作液、加终止液并混匀。最后在酶标仪上检测450nm处的吸光度值并记录。据此绘制标准曲线,根据标准曲线计算并记录样品中IL-1β和TNF-α的浓度。
 
  1.5蛋白提取和蛋白质印迹分析
 
  提取各组细胞总蛋白采用PBS缓冲液冲洗2次,加入1ml的RIPA蛋白裂解液,充分接触后刮下细胞,摇动30min使细胞完全裂解,12000r/min离心5min后收集上清液,BCA法测定各组细胞的蛋白浓度。分别取30μg样本进行SDS-PAGE凝胶电泳实验,将蛋白转移至PVDF膜上,5%BSA室温封闭1-2小时,加入1:10000的兔抗人NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α及1:1000兔抗人β-actin抗体,TBST洗膜三次,每次10min,加入1:1000的羊抗兔二抗,室温孵育1h。加入ECL发光剂后保存条带图片。以目的蛋白的条带的灰度值和内参β-actin的蛋白灰度值比值来确定目的蛋白的相对表达水平,每组实验设置三个复孔。
 
  1.6流式细胞术检测ROS水平
 
  将RAW264.7细胞接种于24孔细胞培养板中,按实验分组分别给予不同浓度的CGRP或LPS处理。在无血清培养基中培养24h后去除培养基,消化离心收集细胞放入EP管,PBS洗一遍,用无血清培养液按1000:1配DCFH-DA,每个样本加1ml工作液重悬。将EP管放入培养箱,孵育30min,每隔3-5min颠倒混匀一次,离心收集细胞,PBS洗3遍,弃上清,1mlPBS重悬后上机检测(FACScan,BD,美国)(激发光为氩离子激光,488nm)。最后流式细胞仪上检测、FlowJo软件(TreeStar)上分析并绘制曲线。各组所检测的活细胞数均大于等于104个。
 
  1.7统计学方法
 
  采用SPSS19.0软件进行统计学分析,实验结果主要为计量资料,均通过正态性检验,以均数±标准差的形式表示,多组间比较实施单因素方差分析+多重比较LSD-t检验。检验水准ɑ=0.05。
 
  2结果
 
  2.1qRT-PCR检测IL-1β、TNF-α和NLRP3的mRNA表达水平
 
  6组IL-1β、TNF-α、NLRP3的mRNA表达水平整体比较,差异有统计学意义(F=26.649,11.439,17.502,P=0.000,0.000,0.000)。与对照组水平相比,LPS组IL-1β、TNF-α、NLRP3的mRNA表达水平增加,差异有统计学意义(t=4.675,2.631,3.121,P=0.001,0.022,0.009);与LPS组相比,CGRP10组、CGRP30组、CGRP100组、CGRP30+LPS组的IL-1β、TNF-α和NLRP3的mRNA表达水平均降低(IL-1β:t=8.483,10.591,7.363,6.335,P=0.000,0.000,0.000,0.000,TNF-α:t=4.369,6.767,5.726,3.955,P=0.001,0.000,0.000,0.002,NLRP3:t=6.374,8.640,5.546,4.335,P=0.000,0.000,0.000,0.001),且CGRP30组最低。如表1、图2所示。
 
  2.2ELISA检测IL-1β和TNF-α的蛋白表达
 
  6组IL-1β和TNF-α的蛋白表达水平整体比较,差异有统计学意义(F=14.564,30.796,P=0.000,0.000)。与对照组水平相比,LPS组IL-1β和TNF-α的蛋白表达水平增加,差异有统计学意义(t=5.351,7.886,P=0.000,0.000),与LPS组相比,CGRP10组、CGRP30组、CGRP100组、CGRP30+LPS组的IL-1β和TNF-α的蛋白表达水平均降低(IL-1β:t=6.464,7.172,5.495,2.642,P=0.000,0.000,0.000,0.021,TNF-α:t=9.563,10.542,8.133,4.315,P=0.000,0.000,0.000,0.001),且CGRP30组最低。如表2、图3所示。
 
  2.3流式细胞术检测细胞内ROS水平
 
  6组ROS水平整体比较,差异有统计学意义(F=52.623,P=0.000)。与对照组相比,LPS组ROS水平增加,差异有统计学意义(t=5.368,P=0.000),与LPS组相比,CGRP10组、CGRP30组、CGRP100组、CGRP30+LPS组的ROS水平均降低(t=8.496,14.197,6.741,5.593,P=0.000,0.000,0.000,0.000),且CGRP30组最低。如表3、图4所示。
 
  2.4免疫印迹法检测ROS-NLRP3信号通路相关蛋白的表达
 
  6组NLRP3、caspase-1、IL-1β和TNF-α的蛋白表达水平整体比较,差异有统计学意义(F=58.374,62.779,127.711,114.531,P=0.000,0.000,0.000,0.000)。与对照组NLRP3、caspase-1、IL-1β和TNF-α的蛋白表达水平相比,LPS组的NLRP3、caspase-1、IL-1β和TNF-α的蛋白表达水平均增加(t=13.557,13.815,23.863,18.779,P=0.000,0.000,0.000,0.000),与LPS组相比,CGRP10组、CGRP30组、CGRP100组、CGRP30+LPS组的NLRP3、caspase-1、IL-1β和TNF-α的蛋白表达水平均降低(NLRP3:t=9.164,14.692,12.729,11.964,P=0.000,0.000,0.000,0.000,caspase-1:t=10.047,15.045,13.952,12.454,P=0.000,0.000,0.000,0.000,IL-1β:t=10.173,14.920,9.185,7.321,P=0.000,0.000,0.000,0.000,TNF-α:t=10.958,19.548,18.140,17.222,P=0.000,0.000,0.000,0.000),且CGRP30组最低。如表4、图5所示。
 
  3讨论
 
  炎症反应常常是由于抗原或异物的入侵、感染等引起的,该过程中会释放多种生物活性物质[10]。脑损伤时巨噬细胞和中性粒细胞常在发生损伤部位的聚集,另外血浆蛋白也会在损伤部位产生免疫反应[11]。炎症反应也可引发多种包括无病原体感染的肥胖、心血管疾病、糖尿病或癌症等。炎症反应是可产生于机体各组织、器官的常见临床病理过程,是机体与致炎因子进行抗争的规律反应[12]。以炎症反应常发生的骨折愈合过程为例,在骨折愈合的血肿机化期,大量炎症细胞浸润,开始吞噬和清除坏死组织,同时骨折处的骨外膜增殖出成骨细胞使血肿机化[13]。巨噬细胞是主要免疫细胞之一,NLRP3是感官病原体和危险信号的多蛋白复合物。免疫细胞中的NLRP3活化可激活半胱天冬氨酸酶(Caspase-1),进一步诱导IL-1β和TNF-α等下游炎症因子的加工与释放。而T细胞、NF-κB和MAPK等信号通路均可被成熟的IL-1β活化,启动先天性免疫应答,从而清除病原体。即在宿主先天性免疫反应中NLRP3活化发挥了极其重要的作用[14,15]。
 
  NLRP3炎症复合体能被多种激活剂所激活,而活性氧ROS则是激活NLRP3的关键。已有研究表明线粒体内ROS是调控NLRP3活化的关键,ROS生成过程若发生自吞噬抑制,则NLRP3激活被抑制,自吞噬过程被抑制或发生障碍则NLRP3被激活。此外,炎症细胞同时分泌的大量细胞因子,如TNF-α、IL-1β、白介素-6、白介素-8和转化生长因子-β等,刺激成纤维细胞增殖分化、胶原蛋白及血管生成[16]。而促炎因子如IL-1β、TNF-α的过表达可显着延长炎症期及创面愈合的时间[17]。因此寻找抑制ROS-NLRP3通路的分子将可能抑制促炎因子IL-1β和TNF-α等的释放,从而为临床上各种炎症反应的治疗提供新的思路。
 
  CGRP为典型的神经肽类,在加速骨折愈合中扮演着关键的角色,其对骨细胞有促进作用[18]。本研究分别以不同浓度的CGRP处理小鼠来源的巨噬细胞RAW264.7,检测CGRP对NLRP3炎症复合体及其下游通路相关的炎症因子活化的影响。通过与对照组或LPS组的比较,比较出细胞或培养上清中NLRP3、IL-1β、TNF-α或ROS水平变化,验证了CGRP可抑制细胞内及细胞上清中炎症复合体NLRP3的mRNA及蛋白表达水平,及抑制ROS-NLRP3通路下游相关的炎症因子或蛋白IL-1β、TNF-α和caspase-1的mRNA和蛋白表达,且抑制细胞内ROS的水平的变化过程。以上研究结果与李翔等人的研究相一致,即巨噬细胞中CGRP也可通过调控细胞内ROS使NLRP3的活性降低,从而使ROS-NLRP3信号通路下游的IL-1β和TNF-α等炎症因子的释放减少,下游通路相关蛋白caspase-1的表达降低,从而可能在降低局部炎症反应中起到重要作用[19,20]。
 
  综上所述,本研究初步阐明CGRP对NLRP3炎症小体及下游炎症因子激活的调节作用,该研究可能为如何降低炎症反应(如加快骨折愈合、伤口愈合等)提供新的临床治疗思路。
 
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