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常用家禽的免疫学检测技术研究

更新时间:2020-05-15 08:11点击:

 摘要:疾病的检测和诊断是禽病防治的重要任务之一。免疫检测是指利用免疫学原理与技术,结合家禽特有的免疫特性,检测家禽抗原、抗体、补体、细胞因子、趋化因子等体液免疫指标以及免疫细胞活性,并通过对这些指标的分析,可以为疾病临床诊断、分析病情、调整饲养、管理、治疗和处理,以及对预后的判断提供重要的参考。在家禽饲养的过程中,如何利用家禽免疫学检测手段,监控不同养殖状态的家禽的体液免疫与细胞免疫功能,并使用科学分析和判断各项免疫学指标,得出对疾病进程的判断尤为重要[1-5]。本文旨在通过介绍目前常用的家禽免疫学检测技术及其要点,为临床禽病检测提供一些理论与技术参考。
 
  关键词:常用家禽,免疫学检测
1 体液免疫相关检测技术
 
  体液免疫检测技术是以抗原抗体结合为核心设计的一系列体外检测家禽体液免疫效应结果的试验技术。根据抗原的物理性状(可溶性或颗粒性)、抗体的类型和反应的条件(电解质、补体、琼脂等)不同,体液免疫效应可表现出凝集、沉淀、细胞溶解、发光、补体结合等反应。体液免疫检测技术的研究历史较长,检测的特异性、精确性和灵敏度高,试剂保存和试验操作方便,易于商品化和标准化,是目前发展最快、应用最广泛的免疫学检测技术之一。血清、血浆、分泌液、禽胚尿囊液、卵黄液、组织切片等均可用于进行体液免疫反应检测,并在常规家禽的免疫学检测中被广泛应用。下文将重点介绍目前禽病检测中常用的体液免疫相关的几种检测技术及其技术要点。
 
  1.1 凝集反应
 
  凝集反应是指细菌或病毒等颗粒性抗原与相应的抗体结合后,在电解质存在的情况下,形成肉眼可见的凝集物的现象。由于凝集反应方法简单,灵敏度高,特异性强,结果直观,在临床上被广泛应用;既可用于抗原或相应抗体的定性检查,亦可将样品连续倍比稀释,对抗原或抗体进行半定量分析。凝集反应分为直接凝集反应和间接凝集反应两大类。如家禽疾病监测中常用到的直接凝集试验,也称为平板凝集试验(SPA),可以用于鸡白痢(SP)、副鸡嗜血杆菌感染(HPg)、小鹅瘟(GP)和鸡支原体感染(MG/MS)等疾病的诊断与鉴定;常用的间接凝集试验,也称为血凝试验(HA)与血凝抑制试验(HI),被广泛应用于新城疫(ND)、禽流感(AI)、减蛋综合征(EDS)、鸡传染性支气管炎(IB)血清中抗体滴度监控和疾病监测,以及ND/AI等病毒性疾病感染的监控手段。检测时,应注意使用固定的抗原浓度,将抗体适当倍比稀释后进行试验,以避免由于抗体浓度过高导致形成的抗原抗体复合物过多而出现非特异性凝集现象。
 
  1.2 沉淀反应
 
  沉淀反应是指在电解质存在的情况下,可溶性抗原与抗体发生特异性的结合而产生肉眼可见沉淀物的现象。根据沉淀反应所用的材料与检测方法的不同,其主要分为液体内沉淀试验、凝胶内沉淀试验和凝胶免疫电泳试验三大类型。在家禽免疫诊断中使用较多的是凝胶内沉淀试验,该试验大多以半固态的琼脂凝胶作为介质,在沉淀反应发生的同时使可溶性抗原与抗体在其中扩散,并形成环状的沉淀线,所以又称琼脂免疫扩散试验。琼脂免疫扩散试验主要分为单向扩散与双向扩散两种。单向扩散是在琼脂凝胶配制的过程中加入少许抗体,使待测抗原溶液从局部向琼脂内扩散并形成可见的沉淀环。单向扩散可用于抗原定量测定方法,操作方法简便、易于观察,如操作规范可保证实验的可重复性与线性良好,但也存在一些弊端如时间较长需要1~2天才能看到结果,灵敏度较低(只能达到μg/m L以上)、对血清的效价、亲和力和特异性要求较高等。双向扩散是让抗原与抗体各自向对方扩散,在比例恰当处形成沉淀线;可以通过观测这种沉淀线的形状、位置以及对比关系,对抗原抗体进行定性分析。双向扩散在禽病免疫检测中应用广泛,如鸡马立克病(MD)、鸡传染性法氏囊病(IBD)、禽流感(AI)、禽霍乱、鸡白痢、鸡住白细胞虫病、禽支原体病、禽曲霉菌病、鸭病毒性肝炎等。免疫电泳是电泳分析与沉淀反应结合的产物,它使用电场加速了沉淀反应的产生,弥补了琼脂扩散实验时间长的缺点;同时,该技术还可利用电场规定抗原抗体的扩散方向,使得其更集中,增强了琼脂扩散检测的灵敏度。进行免疫电泳的关键有以下几点:(1)点样时需注意抗原成分常带负电荷,向正极运动,而抗体随水流方向朝负极运动或不运动;(2)需根据所用的免疫电泳反应选择合适的琼脂凝胶,如对流电泳应选择电渗作用大的琼脂,火箭电泳则应用电渗小或无电渗的琼脂。
 
  1.3 病毒中和反应
 
  抗体与具有生物学活性的抗原发生结合反应,从而失去其应有的生物活性的现象,被称为中和反应。根据中和类型分为病毒中和试验、毒素中和试验、激素和酶中和试验。禽病诊断过程中,常用的中和试验是病毒中和试验。此方法应用广泛:(1)可以从待检血清中检出抗体,或从病料中检出所带病毒,用于鉴定病毒性传染病的种类;(2)用抗毒素血清检查病料中的毒素以及鉴定细菌的毒素类型;(3)配合易感细胞(如IB-DV细胞微量中和试验)、易感鸡胚(如NDV和AIV在鸡胚中进行的中和试验)和易感动物(如使用1~4日龄火鸡进行的火鸡冠状病毒中和试验),测定血清中中和抗体的效价;(4)对病毒和细菌进行血清学分型鉴定(如IBV血清分型以及沙门菌的血清分型)。中和试验的检测特异性强、灵敏度高、定量精确,但同样也存在一些缺陷,如实验操作繁琐,鉴定时的血清需要提前制备,导致某些罕见血清型难以获得。合理使用中和试验能够有效地监控禽群各种病毒性疾病的母源抗体水平以及免疫后抗体的消长规律,以加强免疫管理,在适合的时间进行疫苗补免。其对ND、MD、IB、IBD、ILT、鸭瘟、鸡传染性贫血等病毒性疾病的感染诊断也有非常重要的作用。另外,我国规定,疫苗免疫效力的测试中通常要用中和试验作为评定指标。
 
  1.4 免疫标记反应
 
  免疫标记反应是使用荧光素、酶、放射性核素等作为标记物标记抗原或抗体,对目标抗体或抗原进行检测的一种检测方法。该方法的特异性与灵敏度远高于其他体液免疫检测技术,可以对病原进行定性、定量以及定位分析。因其能够从细胞和亚细胞层次进行抗原或抗体的分析鉴定,该类型技术目前在实验室中被大规模使用于分析疾病的感染状况和进行致病机制的探究。常见的免疫标记有:酶免疫技术、免疫荧光技术、放射性免疫技术、化学发光免疫分析技术、免疫组织化学技术和固相膜免疫技术。在禽病检测中使用较为频繁的是酶免疫技术和免疫荧光技术。
 
  1.4.1 酶免疫反应
 
  酶免疫反应是将抗原抗体的特异性结合反应与酶促反应的高效性与专一性相结合而建立的一种免疫检测技术,是三大经典免疫标记技术中在禽病免疫学诊断领域运用最为广泛的一种技术。它利用酶对目标抗体或者抗原进行结合生成酶标记抗体或抗原,使得结合物既保有原本的生物学活性,又具有酶对底物的催化活性。通过酶促反应的生物放大作用,将抗原抗体的特异性结合更高效地展现出来,提升了检测的灵敏度,适合对抗原或者抗体进行定位、定性和定量分析。
 
  在常规禽病免疫学检测中,发展最快、使用最为频繁的酶免疫反应为酶联免疫吸附试验(ELISA)。该试验具有灵敏度高、特异性好、准确性好、试剂稳定易储存、操作简便、环境污染小等优点。并且,由于目前基本实现了操作标准化、试剂商品化和仪器自动化,同时加入了生物素与亲和素系统(BAS)、单克隆抗体等,使得此反应能够定性、定量分析和检测抗体和抗原滴度,简单快捷且批间误差小。该法缺点是目前大部分酶标板的包被使用的都是物理性吸附,在进行试验时不可避免会产生“背景噪声”导致假阳性结果,从而影响试验结果的准确性。ELISA常用的酶是辣根过氧化物酶(HRP),常用底物为邻苯二胺(OPD)和四甲基联苯胺(TMB)。OPD被认为是HRP最为敏感的色原底物之一,在HRP的作用下一般呈橙黄色,加硫酸或盐酸终止反应后终呈棕黄色,最大吸收峰在492nm波长;但其溶解液稳定性差、易变色,使用时需要现配现用(1h内),且显色反应过程需要全程避光。TMB经HRP作用后液体呈蓝色,经硫酸或盐酸终止反应后液体终呈黄色,最大吸收峰在450nm。TMB相较于OPD更稳定,且显色时不需要避光,无致突变作用,目前已成为应用最广泛的ELISA显色底物,其缺点是水溶性较差。目前国内常见的TMB显色液主要有两种,一种分为A和B两种液态试剂,在使用时需要事先将A和B两种液体进行预混再进行使用(1h内);另外一种为单组份的TMB显色液,可以不需要预混而直接使用;同时在使用显色液之前如发现显色液出现颜色,说明此底物溶液已发生污染,必须废弃。
 
  ELISA既可以用来检测抗原,也可以用来检测抗体。根据检测项目不同而选择不同的检测方法是ELISA试验的核心。常用的方法有:(1)双夹心ELISA法。此方法既可用于抗原的检测也可用于抗体检测,如用于检测鸭病毒性肝炎病毒、NDV、AIV、ALV;(2)直接ELISA法。此方法一般多用于抗原的检测,如副鸡嗜血杆菌;(3)间接ELISA法。此方法一般是在酶标板上固定抗原来检测血清等未知抗体样本,如IBD母源抗体的监测以及IB、CAA、禽支原体感染抗体的检测[6,7,8]。
 
  1.4.2 荧光免疫技术
 
  荧光免疫技术和酶免疫反应类似,也是将抗原抗体反应的特异性与荧光检测技术相结合,通过荧光显微镜或者紫外光照射的普通生物显微镜发生的光波激发荧光基团活性使其发出荧光,从而对抗原或抗体进行监测和分析的一种检测技术,是最早应用的一种免疫标记技术之一,也是三大经典免疫标记技术之一。其主要特点是特异性强、灵敏度高和直观性好。常用的荧光色素有异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗丹明(RB200)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)和藻红蛋白(PE)。其中运用最广泛的是FITC,其主要优点在于:(1)其产生的荧光颜色为黄绿色,较容易被人眼识别;(2)普通标本中绿色较少见,可以有效降低背景色的干扰。
 
  利用荧光色素对抗体进行标记并开展实验的检测方法称为荧光抗体技术(FAT),其运用核心是荧光抗体的制作,根据染色方法的不同分为直接法与间接法两种。直接法常用于抗原的检测中,是将荧光色素与对应抗原的抗体通过化学键结合标记后,直接与相应的抗原发生反应并结合以检测病原体;间接法一般用于抗体的检测中,它是将荧光色素与抗体对应的抗抗体(或称为第二抗体)通过化学键结合标记后,反应时先用抗体与相应的抗原进行反应,再用荧光色素标记的二抗与抗原抗体复合物中的一抗结合。此方法相较于直接法优点在于灵敏度更高、二抗通用性强,一次标记即可检测多种未知抗原或抗体,其缺点是容易产生非特异性荧光。此方法目前已在ND、MD、IB、IBD、鸡传染性鼻炎、鸡传染性贫血、小鹅瘟、禽支原体病等多种禽病的检测中使用,试验结果直观迅速,检测准确率高。
 
  1.5 固相膜免疫技术
 
  固相膜免疫技术与ELISA技术原理类似,它是一种以硝酸纤维素(NC)膜、聚偏氟乙烯(PVDF)膜和尼龙膜等微孔膜作为固相载体的体液免疫检测技术。在兽医检测中常见的为金免疫层析技术,又称胶体金免疫层析技术,常被用于快速检测、定性或者是半定量检测。其原理是利用了金颗粒具有高电子密度的特性,当以金颗粒作为标记物,一旦此标记物在配合体处大量聚集,会形成肉眼可见的红色或粉红色斑点。该实验由于其快速、简便、成本低、稳定性好、可检测样品多样而被广泛用于禽病的临床免疫学诊断,如鸭坦布苏病毒感染(DTMU)、ND、IB、AL、EDS和GP等病毒性疾病以及一些寄生虫感染的抗体监测[9,10,11,12,13,14,15]。此方法同样存在一些缺陷如无法进行精确定量,同时其对抗原的检测灵敏度相对较低。
 
  除以上检测技术外,其他体液免疫技术如间接补体结合试验(用于检测鸡传染性鼻气管炎和衣原体)、化学发光免疫分析检测抗体滴度、显微镜荧光技术进行抗原抗体检测等也可以用于禽病的常规检测。但由于检测范围、仪器和试验场地等要求限制,并没有被大规模地使用和推广。
 
  2 细胞免疫相关检测技术
 
  细胞免疫是指由淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)、单核-巨噬细胞和免疫应答细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)以及其分泌的细胞因子和趋化因子引起的免疫反应的统称。通过检测这些免疫细胞、细胞因子和趋化因子的活性、状态以及表达和功能等,可以为家禽疫苗免疫效果的评估,肿瘤性疾病、自身免疫病、免疫缺陷病的诊断与研究提供参考指标。由于临床发病情况复杂,常伴有继发感染和多重感染的出现,此技术在禽病临床诊断中使用比较有限,下文着重介绍一些在禽病检测中比较常见的细胞免疫检测技术。
 
  2.1 T细胞功能检测
 
  2.1.1 皮肤试验
 
  该法主要是检测T细胞的迟发型超敏反应能力。使用植物血凝素(PHA)作为免疫原,注射至家禽裸露皮肤(肉冠、脚趾附近),根据附近皮肤的肿胀程度则可判断机体的T细胞免疫能力是否健全。
 
  2.1.2 T细胞数量及亚群检测
 
  利用荧光抗体技术或流式细胞仪,使用CD系列单克隆抗体标记不同的T细胞,并根据所带的标记给T细胞进行计数与分群。常用的CD标志有CD3、CD4、CD8等。此方法在临床检测中使用较少,一般多用于与疫苗免疫效果相关的研究。
 
  2.1.3 T细胞功能体外实验
 
  该法主要用于测试机体T细胞功能。使用PHA或特异性抗原(如禽结核菌、禽白血病抗原)刺激体外培养的T细胞,并检测T细胞的增殖与转化情况,从而评估机体的T细胞功能是否健全,或者是否接受了对应抗原刺激。
 
  2.1.4 流式细胞术
 
  流式细胞术是一种利用流式细胞仪,对通过细胞仪中做快速直线运动状态的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性和定量分析以及分选的技术。其工作原理是快速测定荧光值、光散射、光吸收和细胞的库尔特电阻,来定量细胞体积、DNA含量、蛋白质含量、酶活性、膜受体或表面抗原等参数并进行比较,将细胞区分开,以用于生物学研究。目前在家禽的免疫学研究中主要用于进行免疫细胞的计数、分群、活化分析,最常见的应用是进行新型疫苗和佐剂的免疫刺激效果的研究[16,17,18]。由于流式细胞仪价格昂贵且需要良好的实验环境,目前用于禽病的临床诊断相对较少。
 
  总结
 
  不断深入的家禽免疫研究,不仅为禽病的防治与诊断提供了理论依据,而且为我们从家禽的免疫特征中找到合适的切入点,进一步研制成家禽免疫学检测的工具与指标,为禽病的诊断与治疗提供帮助。免疫学检测配合病原学检测进行,极大保证了疾病检测的准确性与灵敏度,使我们在临床诊断中,更好地区分和确定疾病的病因,同时根据结果对症下药,提出切实可行的诊疗方案。禽病免疫学检测技术的灵活运用,使得兽医从业人员能够更精准地掌控禽场中家禽的健康情况,使家禽生产能够得到更好的保障。
 
  参考文献
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  [5]陈溥言.兽医传染病学[M].北京:中国农业出版社,2015:483页.

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