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食源性致病菌免疫学检测方法研究

更新时间:2020-05-21 08:11点击:

摘要:食源性致病菌广泛存在,因其能引起人的疾病甚至死亡,而越来越受世界各国的关注。食源性致病菌传统检测方法为培养法,其费时耗力,不适用于快速检测。本文介绍的免疫学方法具有方便、快速等优点,因而越来越被广泛应用。免疫学检测方法主要有酶联免疫吸附法、免疫层析法、免疫磁珠分离技术、化学发光免疫分析法和乳胶凝集法等。本文着重对这些方法的原理及其应用进行综述,阐述其优缺点,同时对免疫学检测方法未来的发展趋势进行了展望。
 
  关键词:食源性致病菌,免疫学方法,快速检测;免疫学检测
1引言
 
  引发食品安全问题的因素有很多, 比如食品中的毒素、非法添加剂、食源性致病菌等。食源性致病菌是指能够在食品基质中生存或者生长, 并通过人摄食而进入人体导致病变的微生物。由致病菌引起的食源性疾病是食品安全最大的威胁, 其引起的食品安全事件最近国内的报道也越来越多。
 
  食源性致病菌检测方法一般是传统培养法, 前增菌需要8~18 h, 增菌需要18~24 h, 平板分离需要18~48 h,生化试验需要36~48 h, 还要进行复杂的血清学鉴定, 耗时耗力, 很难做到高通量快速检测, 亟需建立快速便捷的检测方法。
 
  免疫学检测方法一般是应用抗体或抗原与相应的抗原和抗体特异性结合产生相应的可被监测到的信号来反应待测样本中是否有待测物质。因抗体与抗原的结合反应迅速且专一性强, 所以一般免疫学检测方法较为灵敏, 特异性强, 速度快。因此免疫学检测方法也越来越受到重视。
 
  2免疫学检验方法进展
 
  2.1食源性致病菌
 
  2.1.1沙门氏菌(Salmonella)
 
  沙门氏菌是一类无芽孢周生鞭毛的革兰氏阴性短杆菌, 有2600多种血清型, 主要分为A、B、C、D、E五个组[1], 多数能产生毒力较强的内毒素和肠毒素。沙门氏菌在中国食物中毒中引起的病例占第一位[2], 在国外, 沙门氏菌也是一种重要的致病菌, 相继有沙门氏菌引起的食物中毒事件的报道, 比如CDC报道的美国“番茄事件”在16个州暴发, 造成145人感染[3]。
 
  2.1.2致病性大肠杆菌
 
  大肠杆菌是一类无芽孢周生鞭毛的革兰氏阴性杆菌,主要存在于人和动物的肠道中, 是肠道正常菌群, 一般不致病, 但有4种大肠杆菌是致病的: 肠道致病性大肠杆菌 (Enteropathogenic E. coli, EPEC)腹泻占婴幼儿腹泻患病率的6~54%[4], 非典型的EPEC有可能引起持续腹泻的发生[5];肠道毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic E. coli, ETEC)会导致腹泻[6],肠道侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive E.coli, EIEC) 会导致血 便 、 腹痛 、 发热[7],肠道出血 性大肠杆 菌 (Enterohemorrhagic E.coli, EHEC)会引起严重的腹痛和血便。2011年美国统计数据表明, EHEC O157是导致病死率最高的因素, 特别是0~4岁儿童病死率更高[8]。
 
  2.1.3志贺氏菌(Shigella)
 
  志贺氏菌是一种有鞭毛的革兰氏阴性短杆菌, 包括痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei)和鲍迪氏志贺氏菌(Shigella boydii)等4个种[9]。志贺氏菌能引起细菌性痢疾,引起发热、炎症、腹痛、痢疾等, 其外毒素引起腹泻, 甚至作用于中枢神经, 造成昏迷或脑膜炎[10]。
 
  2.1.4副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)和霍乱弧菌(Vibriocholerae)
 
  副溶血性弧菌是一种一端生有鞭毛的需氧革兰氏阴性弧菌, 被人食用之后会造成严重肠胃炎[11]。我国《食品安全国家标准食品中致病菌限量》规定其在水产品及相关产品中均不得超过1000 MPN/g[12]。霍乱弧菌是一种重要的致病性弧菌, 对对虾养殖造成危害[13]。感染人后可导致感染者剧烈呕吐、严重腹泻、失水乃至死亡[14]。
 
  2.1.5蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)
 
  蜡样芽孢杆菌是一种周生鞭毛有芽孢的革兰氏阳性杆菌, 其引起中毒的食品范围很广[15]。2003年, 蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒占所有食物中毒事件的4.0%, 为细菌性食物中毒的第4位, 而实际数据很可能远大于各国官方报道, 并且有增长的趋势[16]。
 
  2.1.6肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridiumbotulinum)
 
  肉毒梭状杆菌是一种有鞭毛的严格厌氧的革兰氏阳性菌。能产生肉毒毒素, 为一种强烈的神经毒素, 人中毒后,最初为头晕、无力, 之后出现语言障碍、吞咽困难, 最后出现呼吸困难衰竭而亡, 对人的致死量仅为0.1 μg。
 
  2.2.7金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)
 
  金黄色葡萄球菌是一种无鞭毛需氧或兼性厌氧的革兰氏阳性球菌, 可在含10-15% Na Cl的培养基中生长, 常利用其此点特性选择性培养金黄色葡萄球菌[17]。金黄色葡萄球菌致食物中毒主要归因于其产生的耐热肠毒素, 2000年日本“雪印奶粉”事件, 14000多人受感染[18]。
 
  2.1.8阪崎肠杆菌(Cronobacter)
 
  阪崎肠杆菌是革兰氏阴性无芽孢杆菌, 从阴沟肠杆菌的菌属当中分离出来, 并命名为阪崎肠杆菌[19]。2007年通过基因研究发现, 阪崎肠杆菌与其所属科属亦存有较大差异, 因此将阪崎肠杆菌独自成立为新的菌属, 同时将新菌属命名为阪崎克洛诺[20]。阪崎肠杆菌的易感人群主要是1岁以下的婴幼儿, 可引起新生儿脑膜炎、菌血症等严重疾病, 死亡率高达40%~80%[21]。
 
  2.1.9空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)
 
  空肠弯曲杆菌是一种无芽孢革兰氏阴性菌,可引人的急性胃肠炎和食物中毒的病原菌。感染可以引起人发烧、 急性、自限性胃肠炎、格林-巴利综合征[22]。
 
  2.1.10单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)
 
  单核增生李斯特菌是一种有鞭毛无芽孢的革兰氏阳性菌, 能够引起人类李斯特菌病, 症状多为脑(脊)膜炎、菌血症、腹泻、单核细胞增多等, 并伴发高的致死率。李斯特菌引发的感染大多发生于初生婴儿、怀孕女性及免疫应答低下的人群[23]。无论在发达国家还是在发展中国家, 感染李斯特菌的病例报道呈明显上升趋势[24,25]。
 
  2.2酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)
 
  酶联免疫吸附试验是一种利用酶标抗体或抗原检测相应抗原或抗体的微量检测方法, 其利用酶标抗体或酶标抗原催化显色底物显色来定性甚至定量分析。ELISA既利用了抗原抗体之间免疫特异性, 又利用了酶催化的高效性,故该方法特异性好、灵敏度高。
 
  一般的, ELISA法分为双抗夹心法和间接竞争法, 检测大分子(包括致病菌)一般用双抗夹心法, 间接竞争法一般用于检测特异性抗体。伍燕华等[26]以福尔马林灭活的鼠伤寒沙门氏菌免疫雌性日本大耳兔, 制备抗沙门氏菌多克隆抗体, 并以此作为捕获抗体, 以抗沙门氏菌单克隆抗体C1359作为检测抗体, 建立快速检测沙门氏菌双抗夹心ELISA方法。采用该法对沙门氏菌A、B、C、D、E等五种典型菌株进行筛查, 沙门氏菌的检测范围大大增加, 最低检测量为1×104cfu/m L, 与其他杂菌不存在交叉反应, 具有较好的灵敏性和特异性。段霞等[27]以免疫日本大耳兔获得抗单核细胞增生李斯特氏菌多克隆抗体作为捕获抗体, 以抗单核细胞增生李斯特氏菌Internalin A(Inl A)单克隆抗体作为检测抗体,建立快速、特异的检测该菌的双抗夹心ELISA方法。其最低检测量可以达到1.7×105cfu/m L。Bang等[28]建立了检测鼠伤寒沙门氏菌的间接竞争法, 该方法最低检测限可以达到106cfu/m L, 且与大肠杆菌O157、莫金斯克洛诺斯氏菌、产气肠杆菌以及肠炎沙门氏菌都没有显着的交叉反应, 具有良好的特异性。
 
  2.3免疫层析法(immunochromatography,IC)
 
  2.3.1胶体金免疫层析技术(goldimmunochromatographyassay,GICA)
 
  胶体金免疫层析技术是一种将胶体金标记技术、免疫学检测和层析分析技术有机结合的快速筛查法。其原理是利用胶体金标记的抗原或抗体与相应的抗体或抗原特异性结合, 利用胶体金显色来达到定性或者定量的目的。
 
  通常所用的GICA根据原理可分为双抗夹心法和竞争抑制法, 信号的强度与目标待测物的浓度分别成正比和反比。一般双抗夹心法主要检测大分子物质(包括致病菌), 竞争抑制法主要用于检测小分子抗原。
 
  该方法简捷、快速、低耗, 不需要专业操作人员和复杂仪器即可进行, 定性检测只需目测。夏诗琪等[29]研制出的试纸条特异性高(试纸条与大肠杆菌CMCC 25922、大肠杆菌NCTC 12900、金黄色葡萄球菌CMCC 45401、弗氏柠檬酸杆菌ATCC 43864存在弱阳性反应,与其他菌以及PBS缓冲溶液呈阴性反应)、灵敏度好(甲型副伤寒沙门氏菌的检测灵敏度最高, 为105cfu/m L,鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鸭沙门氏菌的检测灵敏度为106cfu/m L)、稳定性强(常温干燥的条件下预计能保存6个月)。黄岭芳等[30]以浓度为16.8 μg/m L的抗体在p H 8.0下与胶体金标记, 再以PEG 20000作封闭剂封闭后, 喷于金垫上, T线和C线分别喷以大肠杆菌O157:H7多克隆抗体和驴 抗鼠抗体 ( 二抗 ), 以此研制 出检测大 肠杆菌O157:H7胶体金试纸条, 该试纸条灵敏度为104cfu/m L, 且特异性较好。Chalinan等[31]研制出一种高灵敏度的胶体金试纸条以检测海产品中的霍乱弧菌O139, 该试纸条直接检测样品其最低检测限能达到104cfu/m L,但若经过样品的前增菌培养再检测, 其最低检测限可达1 cfu/m L。
 
  2.3.2碳纳米颗粒免疫层析(carbonnanoparticlesimmunochromatographyassay)
 
  碳纳米颗粒免疫层析是一种用碳纳米颗粒标记的抗体或抗原与相应抗体或抗原特异性结合, 利用碳颗粒聚集显色来定性或者定量检测目标物质的免疫学检测方法。
 
  碳纳米颗粒免疫层析原理基本与GICA相似, 不同之处在于所用的抗体标记物不同。碳纳米颗粒相较于胶体金的优势在于其价格低廉, 无毒, 信号明显(碳黑色与NC膜的白色形成色差), 易于与配体结合[32,33]。
 
  Martina等[34]研制了一种检测阪崎肠杆菌的碳黑核酸试纸条, 其用一种特异性引物扩增阪崎肠杆菌中一段16S r RNA, 扩增产物一端连有异羟基洋地黄毒苷, 另一端连着生物素。碳纳米颗粒标记亲和素(与生物素结合), 硝酸纤维素(NC)膜上检测线(T线)喷有抗异羟基洋地黄毒苷抗体,控制线(C线)喷有蛋白标记的亲和素。试纸条的检测原理是碳纳米颗粒-亲和素-生物素-16S r DNA-异羟基洋地黄毒苷-抗异羟基洋地黄毒苷抗体的模式, 其检测灵敏度为8ng(PCR产物量)。
 
  2.3.3荧光微球免疫层析技术(fluorescentmicrosphereimmunochromatographictechnique)
 
  荧光微球免疫层析技术是一种以荧光微球偶联抗体与待测抗原特异性结合, 利用荧光微球的荧光信号来达到定量目的的检测手段。其层析原理一般与胶体金层析技术一致, 但仪器检测荧光微球的信号相对于胶体金的显色来说要优越得多, 定量的灵敏度更高。
 
  解泉源等[35]研制出一种检测大肠杆菌O157:H7的荧光微球免疫层析试纸条。该试纸条NC膜上T线和C线分别喷有大肠杆菌O157:H7兔多抗和驴抗鼠二抗, 质量浓度均为1.5 mg/m L, 喷量均为0.75 μL/cm,与荧光微球偶联的抗体选用鼠抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体, 其用量为100 μg/mg荧光微球。试纸条肉眼观察检测限为1.2×104cfu/m L, 借助荧光读取仪检测限能提高到6.1×103cfu/m L,其特异性良好(除与金黄色葡萄球菌有微弱交叉反应外)。 Il-Hoon等[36]应用荧光微球免疫层析技术实时联检大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌及单增李斯特菌, 其检出限为5 cfu/m L。Xu等[37]以抗空肠弯曲杆菌PEB1蛋白单克隆抗体喷涂T线, 羊抗兔多克隆抗体喷涂在C线, 建立了一种以荧光微球作为标记物的免疫层析试纸条以快速检测空肠弯曲杆菌。该法快速简单, 最低检测限能达到106cfu/m L。
 
  2.3.4量子点免疫层析技术(quantumdotsimmunochromatographictechnique)
 
  量子点(quantum dots, QD)是一类半径小于或接近于激光玻尔半径(直径约为2~6 nm),能够接受激发光产生荧光的半导体纳米颗粒, 其组成一般为Ⅱ-VI族或Ⅲ-V族元素。量子点相比于荧光微球其荧光强度强、稳定性好、抗漂白能力强、生物相容性好、荧光寿命长, 且量子点的激发光的波长范围很宽, 而发射光波长范围很窄[38]。
 
  Chen等[39]利用磁分离富集金黄色葡萄球菌的DNA,再结合PCR技术扩增目标DNA, 以QDs为标记物, 采用一种新型的免疫层析方法——利用链霉亲和素和生物素结合以放大信号来检测金黄色葡萄球菌。其在牛奶样品和肉样中检出限分别为3×100 cfu/m L和3×101cfu/g。Bruno[40]比较了以胶体金和量子点作为标记物的两种试纸条来检测大肠杆菌O157, 并以365 nm紫外光作为激发光, 采用橙色肖特玻璃滤光器来增强量子点荧光信号, 最终二者的检测限分别为6000 cfu/m L和600 cfu/m L。
 
  2.4免疫磁珠分离技术(immunomagneticbeadsseparationtechniques,IMS)
 
  免疫磁珠分离技术是一种将免疫特异性和磁性材料在磁场中的磁响应性相结合的免疫学技术。该技术是利用抗体偶联的磁珠与相应的靶细菌特异性结合, 在外部强磁场作用下从样本中分离出靶细菌。
 
  Xiong等[41]建立了一种利用免疫磁珠分离技术高效富集大肠杆菌O157:H7的方法, 靶细菌(大肠杆菌O157:H7) 的捕获效率可达98%(磁珠量为0.05 mg, 菌数为10~106),非靶细胞低于2%(除金黄色葡萄球菌的为23.6%), 即使在食品基质中也有很好的表现(牛肉糜和牛奶中捕获效率分别为94.4%和99.8%)。山珊等[42]利用免疫磁珠分离法富集沙门氏菌, 并对其条件进行优化: 当磁珠量为0.4 mg, 抗体标记量为50 μg/mg(磁珠), 菌液浓度为102~106cfu/m L时, 其捕获效率为65%~82%。Lin等[43]在磁场强度为1.35T磁强梯度为90 T/m的强磁场下, 使用30 nm及180 nm的磁珠来富集大肠杆菌O157, 二者在菌液浓度在102~105cfu/m L范围内捕获效率都可达90%以上, 且与鼠伤寒沙门氏菌和无害李斯特菌没有明显的非特异性结合。
 
  IMS应用于检测时一般会与其他方法联用, 其主要作用在于分离和富集待测物质。Cui等[44]先利用免疫磁珠分离技术从样本中分离出大肠杆菌O157:H7, 再将分离出的靶细菌重悬液利用胶体金层析试纸条定量检测大肠杆菌O157:H7, 其检出限为7.6×103cfu/m L。
 
  2.5化学发光免疫分析法(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA)
 
  化学发光免疫分析是将发光底物或酶(催化发光底物发光)标记在抗体上, 待免疫反应后加入酶或发光底物与之反应产生肉眼可见或被仪器检测的光信号, 根据光信号的强弱来定量检测样品的浓度。因其不需要外加光源的激发, 检测仪器相比于普通荧光读取仪更为简便。
 
  根据化学发光免疫分析体系中所选标记物的不同,将化学发光免疫分析方法分为化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析及电化学发光免疫分析3大类[45]。
 
  房芳等[46]建立了一种利用化学发光免疫分析检测沙门氏菌的方法, 其将辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔Ig G作为酶标二抗, 沙门氏菌多克隆抗体作为一抗, 鲁米诺和H2O2作为发光底物, 可同时检测猪霍乱沙门氏菌 (Salmonella choleraesuis) 、鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) 和肠炎沙门氏菌 (Salmonella enteritidis), 检测限为1×104cfu/m L, 检测准确率可达到97.33%。Shiro等[47]利用活菌与醌类发生氧化还原反应释放活性氧的特性,建立了一种甲萘醌(或辅酶Q1, 也是一种醌类物质)-乙二胺四乙酸钼-鲁米诺化学发光系统, 来检测样本中活菌的量, 酵母菌和细菌的检出限均为103CFU/m L。Park等[48]根据双抗夹心原理, 巧妙结合酶联免疫技术, 建立了一种高灵敏检测大肠杆菌O157的系统, 该系统利用辣根过氧化物酶-单克隆抗体作为检测抗体, 多克隆抗体固定在试纸条上, 鲁米诺和H2O2作为发光底物, 其定量检测范围为1.8×103~1.8×108cfu/m L。
 
  2.6乳胶凝集法(latexagglutinationassays,LTA)
 
  乳胶凝集试验是一种将可溶性抗原(或抗体)吸附在聚苯乙烯乳胶颗粒上, 与相应的抗体或抗原特异性结合后就会使乳胶凝集的检测方法。这种方法的特点是方便快捷,不需要任何仪器设备。
 
  Medina等[49]利用LTA检测六种血清型的大肠杆菌 (O26, O45, O103, O111, O121, O145)。其制备的Ig G-乳胶复合物易于制备、稳定性好(至少保存一年), 且特异性较好 (O26、O103、O145之间有少许交叉反应)。Fusun等[50]利用头孢西丁纸片扩散法和乳胶凝集法评价含mec A基因的金黄色葡萄球菌对甲氧西林的抗性, 并且对比了基因mec A和fem A、fem B、fem X对其抗性的影响。
 
  3结论
 
  快速简便的免疫学检测方法虽然已得到公众的认可,但其相较于经典的仪器检测法在灵敏度和特异性方面还需要发展,随着科技的进步, 定性分析已不能被满足, 而定量分析同样是免疫学检测法的软肋。如何克服灵敏度和特异性之间的矛盾, 如何达到精准的定量分析, 将会是免疫学检测法长期的研究问题。

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