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过敏性疾病的免疫学检测研究

更新时间:2020-05-21 08:12点击:

 摘要:判断患者过敏和找到过敏原, 可通过与过敏相关的免疫学检测进行。免疫学检查是机体识别“自身”与“非己”抗原, 对“自身”抗体形成天然免疫耐受, 对“非己”抗原产生排斥作用的一种生理功能的检测。检测出过敏原, 并尽量避免与之接触, 减少过敏性疾病的发生[1,2]。过敏性疾病的免疫学检测主要包括血清总免疫球蛋白E (Ig E) 、特异性Ig E检测和过敏原皮肤试验, 此外还有特异性激发试验和嗜碱粒细胞释放介质能力检测等, 其中过敏原皮试是基本、常用的检测方法, 至今无法被取代。过敏原皮试和激发试验属体内试验, 而上述其他试验则属于体外试验。
 
  关键词:过敏性疾病,免疫学检测
1 过敏原皮肤试验
 
  过敏原皮肤试验简称皮试, 是将微量无害的可疑过敏原注入皮肤, 与皮肤中致敏肥大细胞表面的特异性Ig E相结合, 经一系列的酶激活, 使肥大细胞脱颗粒, 释放组胺等多种化学介质, 从而使注入处局部皮肤出现丘疹和红晕反应。皮肤试验主要用于检测Ⅰ型和Ⅳ型变态反应。
 
  1.1 皮试液的选择。
 
  (1) 过敏原皮试液:需根据临床资料、年龄、发病季节、地域和环境因素而定。选用空气中常见的过敏原, 如尘螨、花粉、蟑螂、真菌、宠物皮毛屑等浸液;食物过敏原多选用牛奶、鸡蛋、虾、蟹以及大豆、花生等[3,4,5]。 (2) 皮试对照液:为了得到准确的皮试结果, 做皮试应同时设阳性和阴性对照。阳性对照液常用二盐酸组胺或二磷酸组胺。阴性对照液多选用生理盐水或过敏原稀释保存液。
 
  1.2 皮肤试验方法
 
  皮肤试验的方法主要有点刺试验、皮内试验、划痕试验和斑贴试验等。目前临床上常用的是点刺试验。皮肤点刺试验临床应用广泛并逐渐取代皮内试验。方法是用点刺针点刺表皮, 将极微量的皮试液渗入皮肤, 是非皮内注射的一种既简便又可靠的皮试方法。点刺试验观察结果和丘疹直径测量的方法同皮内试验, 结果判断的参考标准如下:以过敏原皮试液所致丘疹面积与阳性对照液所致丘疹面积之比值, 来定其反应级别。无丘疹 (-) ;丘疹不明显 (±) ;比值≥25% (+) ;≥50% (++) , ≥100% (+++) , ≥200% (++++) 。 (+++) 以上可有伪足出现。国外目前已推广了分别涂有各种不同过敏原并经密封包装的点刺器具, 使用时只要打开包装, 无需再滴加皮试液, 并备有阴、阳性对照。这种方法被称为“干点刺试验”。该方法还未被应用于国内临床。
 
  2 激发试验
 
  人为地将某种过敏原或非过敏原刺激物对靶器官进行刺激, 继而通过所引发的症状和 (或) 靶器官功能改变, 来确定该物质是否为引发患者症状的病因, 或了解器官的反应性。用于诊断过敏性鼻炎-哮喘综合征的激发试验是支气管激发试验[6]。由于目前特异性支气管激发试验 (用过敏原刺激) 很少应用, 而主要采用非特异性刺激, 如醋甲胆碱、组胺、运动等, 来观测患者的气道反应性, 故目前“支气管激发试验”一词以“气道反应性测试”的出现频率较高。除了支气管激发试验外, 其他的激发试验有鼻黏膜激发试验、眼结膜激发试验、口服激发试验等。食物激发试验适用于对某种食物有过敏史而其皮试结果又与病史不符的患者。为使试验更具客观性, 排除患者的主观和精神因素, 食物激发试验尽可能采用双盲安慰剂对照激发。
 
  3 体外检测技术和主要检测项目
 
  3.1 血清免疫球蛋白E检测
 
  血清Ig E的检测包括血清特异性Ig E和血清总Ig E, 前者是指针对某种过敏原所产生的Ig E, 用于检测某人对某一过敏原是否过敏;而后者则是测定血清中Ig E的总含量。血清Ig E的检测目前普遍采用的是标记免疫分析技术, 该类技术包括放射标记免疫分析法 (放免法) 、酶标记免疫分析法 (酶标法) 、胶体金标记免疫分析法 (金标法) 、酶标记荧光免疫分析法 (荧光酶标法) 和化学发光法等。正常成人血清Ig E含量一般<150 IU/ml。 (1) 放射性过敏原吸附试验 (RAST) :RAST结果准确, 但因需一定设备、费时, 加之放射性核素有半衰期和一定的放射污染, 故目前应用较少。 (2) 酶联免疫吸附试验 (ELISA) :ELISA是酶标法中最常用的方法。采用ELISA检测s Ig E, 其灵敏度、特异性与RAST相仿, 而且价廉。 (3) 胶体金标记免疫分析法 (金标法) :金标法的最大优点在于快速、操作简便, 只要滴一滴血清就可以检测, 15~20分钟观察结果, 检测报告立等可取。其缺点是灵敏度较低, 只能定性或半定量。 (4) 酶标记荧光免疫分析法 (荧光酶标法) :荧光酶标法 (FEIA) 可看作荧光和酶标技术的结合。该法目前用于全自动的CAP过敏原检测系统 (CAP系统) 检测仪进行自动检测。灵敏、可靠, 而且检测时间仅需3小时, 给临床工作带来了极大的方便。该系统不但能够检测过敏原特异性Ig E, 还能检测多种过敏性疾病的重要指标, 如总Ig E、嗜酸粒细胞阳离子蛋白、类胰蛋白酶、Ig A、Ig G以及许多自身免疫性疾病的指标等。目前提供的商品化过敏原检测品种有500多种。 (5) 化学发光酶免疫分析法:化学发光酶免疫分析法是将化学发光与免疫反应相结合, 用以检测抗原或抗体的方法。在血清特异性Ig E检测上, 有1次检测30多种过敏原的Mast检测法。
 
  3.2 血清特异性Ig E (s Ig E) 检测
 
  特异性Ig E是特应性个体针对某一种过敏原刺激所产生的Ig E, 特异性Ig E的检测在过敏反应体外诊断中占有重要地位。国内目前较多采用的是敏筛检测, 敏筛过敏原检测系统采用免疫印迹法, 定量检测人血清中过敏原特异性Ig E抗体。特异性过敏原被吸附于硝酸纤维素膜表面, 与病人血清中过敏原特异性的Ig E抗体结合。再与生物素标记的抗人Ig E抗体结合, 然后加上碱性磷酸酶标记的链霉亲和素。在加入BCIP/NBT酶作用底物孵育后, 发生特定的酶显色反应, 试剂条上出现沉淀。颜色深浅与血清中s Ig E抗体含量成正比。敏筛定量过敏原检测系统具有极其良好的重复性、敏感度、特异性和准确性。与过敏原皮试相比, 血清特异性Ig E检测具有更高的可靠性, 此外, 对于药物、皮肤敏感性等影响而无法做皮试, 或皮试结果不可靠者, 血清特异性Ig E检测能显示其优势。血清特异性Ig E检测, 也是选用特异性免疫疗法 (脱敏治疗) 的依据之一。
 
  3.3 芯片技术
 
  美国Ray Biotech推出通量最高的双抗夹心法抗体芯片, 同时进行定量或半定量检测, 灵敏度、准确性更高。高通量筛选的优点是:在未知细胞因子表达之前, 通过一个检测工具就可以宏观表现细胞因子的情况, 进而对发现新的标志物和指导后续试验具有重要意义。目前, 该技术还没有应用到临床。
 
  3.4 嗜碱粒细胞释放介质能力的体外检测
 
  血清Ig E的检测, 只能反映患者血清中是否存在过敏性抗体, 而对于与过敏反应密切相关的其他因素, 如Ig E与肥大细胞/嗜碱粒细胞的结合能力, 以及这些效应细胞在过敏原与Ig E结合后释放介质的能力等, 则无法反映, 因此, 过敏反应效应细胞释放介质能力的检测就显得非常重要。由于嗜碱粒细胞在功能上, 尤其是在过敏反应的机制上与肥大细胞有着许多共同点, 且易于在数毫升静脉血中分离获得, 所以, 临床上将嗜碱粒细胞作为试验对象。嗜碱粒细胞释放介质能力的检测方法, 主要有嗜碱粒细胞组胺释放试验和嗜碱粒细胞脱颗粒试验。嗜碱粒细胞组胺释放试验:嗜碱粒细胞经纯化、洗涤后所得的悬液, 用刺激剂 (过敏原或其他物质) 刺激后, 释放介质组胺。通过测定组胺的量, 来反映嗜碱粒细胞释放介质的能力。该方法灵敏度高、结果可靠。嗜碱粒细胞脱颗粒试验:嗜碱粒细胞胞浆内硫酸肝素颗粒可被碱性染液 (如甲苯胺蓝、阿利新蓝等) 染色。试验的方法主要有甲苯胺蓝染色的玻片法和阿利新蓝染色的试管法。
 
  3.5 无创性气道过敏性炎症指标的评价。
 
  (1) 嗜酸粒细胞阳离子蛋白 (ECP) 的测定:ECP是由嗜酸粒细胞激活后所释放的毒性蛋白之一, 是嗜酸粒细胞活化的标志, 也是反映气道炎症发生发展的敏感指标。CAR-AS患者血清和诱导痰中的ECP水平明显高于正常人, 此种高水平与支气管肺泡灌洗液 (BALF) 中的ECP水平有很好的一致性, 且与CARAS的病情严重程度相关。临床上主要开展的是血清ECP含量的测定。 (2) 类胰蛋白酶的测定:肥大细胞在过敏反应中起重要作用。测定血清、诱导痰中类胰蛋白酶的含量和活性, 能了解肥大细胞的活化程度。类胰蛋白酶是肥大细胞分泌颗粒中特有的一种丝氨酸蛋白, 其含量占肥大细胞总酶量的三分之一, 可作为肥大细胞活化的标志, 在CARAS发病机制中具有重要作用。血清类胰蛋白酶含量的测定常采用荧光酶标法的CAP系统进行。血清类胰蛋白酶的正常参考值为<5μg/L。 (3) 细胞因子和黏附分子的检测:细胞因子是指由活化的免疫细胞及某些基质细胞表达并分泌的一系列生物活性物质, 其化学本质为蛋白质或多肽。黏附分子是一系列介导细胞间、细胞与细胞外基质间黏附, 并具有细胞间传递信息和调节细胞功能等作用 (包括炎症调节) 的糖蛋白。细胞因子和黏附分子的检测方法主要有:生物学检测法、免疫学检测法、分子生物学方法、免疫组织化学法。 (4) 尿中白三烯E4 (LTE4) 测定:白三烯由嗜碱粒细胞、肥大细胞和嗜酸粒细胞产生, 与过敏性鼻炎哮喘综合征的发作有关。LTE4是白三烯中的一个组分。 (5) 呼出气体中一氧化氮浓度测定:细胞内的一氧化氮合酶 (NOS) 。分为固有型NOS (c NOS) 和诱导型NOS (i NOS) 两种类型。过敏性鼻炎患者由于气道炎症细胞聚集及气道上皮损伤, i NOS活性增加以及NCNA神经末梢的NO异常释放, 使气道内NO浓度明显增加。正常人呼出气体中的NO浓度为10~25ppb。 (6) 诱导痰分析:诱导痰是让患者雾化吸入高渗氯化钠溶液诱导后所获取的痰液。利用诱导痰, 可进行痰中细胞分类和检测多种细胞活性物质 (如细胞因子) 以及细胞活性物质的mRNA表达等。诱导痰中细胞因子的检测亦是无创性气道炎症指标, 如白介素-4 (IL-4) 、IL-5、IL-6、IL-8和可溶性白介素-2受体 (s IL-2R) 、γ-干扰素 (IFN-γ) 、肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 、粒-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 等检测, 有助于气道炎症的判断。诱导痰分析目前应用较多的是痰液中嗜酸粒细胞数量和嗜酸粒细胞阳离子蛋白 (ECP) 水平分析。 (7) 胸腺基质淋巴细胞 (TSLP) :TSLP能够引发骨髓外造血过程, 并激发过敏性炎症, 从而引起各类过敏性疾病。TSLP的相关免疫学应用将拭目以待。
 
  4 生物共振仪检测过敏原
 
  生物共振过敏原检测系统的检测原理属于量子医学范畴, 主要通过红外线扫描器, 对患者的双手指甲褶处的微血管进行扫描检测。以基础波值为基准, 当人体与上述过敏原样本产生共振反应并超过基础波阈值时即可确认对该过敏原过敏[6,7]。该方法优点是没有痛苦, 可以同时检测500~1000余种过敏原, 费用相对低廉, 但结果的精确性仍然有一定争议。
 
  参考文献
  [1]张田, 陈剑秋, 朱春生, 等.济南市过敏性鼻炎患儿血清s Ig E检测分析[J].中国临床医生, 2013, 41 (10) ∶55-56.
  [2]文昭明.变态反应性疾病的诊治[M].北京:人民卫生出版社, 2002.28-36.
  [3]李明华, 殷凯生, 蔡映云.哮喘病学[M].第2版.北京:人民卫生出版社, 2005.16-30.
  [4]Turvey SE, Cronin B, Arnold AD, et al.Antibiotic desensitization for the allergic patient:5years of experience and practice[J].Ann Allergy Asthma Immunol, 2004 (92) ∶426.
  [5]LEWIS SA, Weiss ST, Platts–Mills TA, et al.The role of indoor allergen sensitization and exposure in causing morbidity in women with asthma[J].Am J Respir Crit Care Med, 2002 (165) ∶961-966.
  [6]Taramarcaz P, Gibson PG.The effectiveness of intranasal corticosteroids in combined allergic rhinitis and asthma syndrome[J].Clin Exp Allergy, 2004, 34 (12) ∶1883-1889.
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