27医学论文范文网

主页
分享医学论文范文

浅析恶性疟疾疫苗的研制

更新时间:2020-05-28 08:11点击:

    摘要:目的制备针对恶性疟原虫环子孢子蛋白( circumsporozoite protein, CSP) NANP四肽重复序列[Asn-Ala-Asn-Pro (NANP ) repeated motif]的单克隆抗体。方法采用马来酰亚胺修饰的BSA与(NANP) 5C偶联法及ADH-EDC 介导的BSA 与(NANP) 5偶联法,将合成的NANP 多肽与载体蛋白偶联,免疫BALB / c小鼠后,采用免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2 / 0杂交的细胞融合技术,获得分泌抗(NANP) 5多肽单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株,间接ELISA 法检测效价。通过免疫F1小鼠诱生腹水,采用50%硫酸铵沉淀法盐析纯化后,进行单克隆抗体亚类和特异性鉴定。结果采用2种方法制备了BSA (-NANP) 5偶联蛋白,以该蛋白为抗原,获得1C株抗(NANP) 5多肽阳性杂交瘤细胞株,效价在1 : 80 000 ~ 1 : 640 000之间,均为IgG1 亚类,轻链类型为k,可被(NANP) 5及CSP抗原特异性识别。结论成功制备了抗(NANP) 5多肽的单克隆抗体,该抗体可在恶性疟疾疫苗的研发中发挥重要作用。
 
    关键词:疟疾;环子孢子蛋白; NANP ;四肽重复序列;单克隆抗体
 
疟疾是以疟原虫为病原体并通过按蚊叮咬传播的寄生虫病,是世界上分布和流行最广的寄生虫性疾病之一,世界上约有 20 亿人口生活在疫区[1].在我国,疟疾也是一种严重危害人类生命健康的疾病。
 
  2010 年我国政府公布了《中国消除疟疾行动计划(2010 ~ 2020 年)》,提出在 2020 年全国实现消除疟疾的目标[2].因此,对中国以及全球来说,迫切需要研制预防疟疾的疫苗。
 
  疟原虫生活史复杂,包括有性、无性两个阶段三个时期。由于疟原虫抗原在各个时期不同,抗原性较弱且有多个抗原表位,加之疟原虫的致病机理尚不十分清楚,这些因素给疟疾疫苗的研究带来了极大的困难。
 
  根据疟原虫在人体的生活史,可将疟疾疫苗分为 3 种,即抗红前期原虫疫苗、抗红内期原虫疫苗和传播阻断疫苗。位于子孢子表面的环子孢子蛋白(circumsporozoite protein,CSP)是抗红前期原虫疫苗的重要候选抗原。Dame 等[3]研究发现,在 CSP 蛋白中存在重复 37 次的 Asn-Ala-Asn-Pro(NANP)四肽重复序列(NANP repeated motif),该序列重复 4 次,而且这种重复无株间差异。Gerloni 等[4-5]构建了包含3个重复的 NANP 四肽重复序列的 IgG 重链基因的重组质粒,并用该质粒免疫小鼠后,在持续 2 年的时间内观察到机体产生了特异的抗 NANP 反应。
 
  Kubler-Kielb 等[6]通过蛋白质水平的偶联技术,实现了将 4 或 5 个重复的 NANP 四肽重复序列与pfs25蛋白质自身聚体的物理连接,并将此复合物免疫小鼠,结果显示,小鼠体内可产生特异性的抗 pfs25 蛋白及抗 CSP 应答。
 
  基于 CSP 蛋白结构,美国葛兰素史克生物公司(GSK)研发了 RTS,S / AS01 恶性疟疾疫苗,2011 年的初步研究结果显示,在为期 12 个月的观察期内,6 000 名 5 ~ 17 月龄幼儿注射 3 剂疫苗后,患疟疾和恶性疟疾的风险分别降低了 56%和 47%[7].这是恶性疟疾疫苗至今获得的最好的实验数据。
 
  NANP 四肽重复序列仅是 CSP 蛋白质的一个结构区域,若开发针对该四肽重复序列的单克隆抗体,则可提供检测该序列的特异性和敏感性,有益于基于 NANP 四肽重复序列的各项基础及应用研究。因此,本实验以 BSA(-NANP)5 偶联蛋白为免疫原,利用经典杂交瘤技术,筛选出 10 株杂交瘤细胞株,为进一步的研究工作奠定基础。
 
  1 材料与方法
 
  1. 1 多肽及细胞 (NANP)5 多肽、(NANP)5C 多肽均由本公司委托北京赛百盛生物公司合成,经HPLC 纯化后纯度为 95%,各合成 50 mg;SP2 / 0 骨髓瘤细胞由本公司第四研究室保存。
 
  1. 2 实验动物 SPF 级 BALB / c 鼠,雌性,6 ~ 8 周龄,体重 12 ~ 14 g,动物合格证号为:SYXK(甘2012-0002);清洁级 F1 鼠,雌性,体重 16 g 以上,动物合格证号为:SYXK(甘 2012-0003),均由本公司动物实验室提供。
 
  1. 3 主要试剂 RPMI1640、胎牛血清、黄嘌呤(hy-poxantin,HAT)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin)培养基购自美国 GIBCO 公司;HRP、过碘酸钠(NaIO4)、HRP 标记的兔抗鼠 IgG、免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒、己二酸二酰肼(adipicdihydrazide,ADH)、BSA、乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺[1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)CarbodiimideHydrochloride,EDC]购自美国 Sigma 公司;Imject Ma-leimide Activated BSA Kit 购自美国 Thermo Scienti-fic 公司;弗氏佐剂由本公司第四研究室制备;2(-N-吗啉代)乙磺酸[2(-N-Morpholino)ethanesulfonic acidhydrat,MES]、硫氰酸氨、秋水仙素、考马斯亮蓝 R-250 等为国产试剂。
 
  1. 4 抗原板条 (NANP)5 及(NANP)5C 多肽、戊型肝炎病毒(HEV)、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、睫状神经生长因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)等抗原板条由本公司第四研究室制备并保存;CSP蛋白为中国食品药品检定研究院细菌一室惠赠[8],并由本公司第四研究室制备抗原板条。
 
  1. 5 完全抗原的制备 选择 BSA 作为载体蛋白,应用以下 2 种方法将(NANP)5 或(NANP)5C 多肽与载体蛋白偶联。方法 1[马来酰亚胺修饰的 BSA 与(NANP)5C偶联法:马来酰亚胺修饰的BSA与(NANP)5C 偶联,具体操作按 Imject Maleimide ActivatedBSA Kit 试剂盒说明书进行:用 1 ml 的偶联缓冲液(0. 083 mol / L sodium phosphate,0. 1 mol / L EDTA,0. 9 mol / L NaCl,0. 1 mol / L sorbitol,0. 02%叠氮钠,pH 7. 2)配制马来酰亚胺修饰的 BSA,使载体蛋白终浓度为 10 mg / ml,取 0. 5 ml 用于偶联,同时用0. 5 ml 偶联缓冲液配制(NANP)5C 多肽 25 mg,终浓度为 50 mg / ml;将多肽与载体蛋白混匀,室温孵育 180 min;以 0. 083 mol / L PBS,pH 7. 2 作为透析缓冲液透析偶联产物,过夜。方法 2[ADH-EDC介导的 BSA 与(NANP)5 偶联法]:在 0. 5 ml BSA(25 mg / ml)中加入 0. 5 ml ADH(以 0. 1 mol / LNaCl 为溶剂配制,浓度为 0. 25 mol / L),加入 0. 5 ml0. 2 mol / L MES,调 pH 至 5. 6,加入 4. 5 mg EDC(浓度为 0. 05 mol / L),室温反应 6 h,期间用 0. 05 mol / LHCl 调 pH 至 5. 6;以 0. 5 mol / L NaCl,pH 7. 2 作为透析缓冲液,透析偶联产物,过夜;取 0. 5 ml 透析产物,加入 0. 5 m(lNANP)5(以 0. 2 mol / L MES 为溶剂配制,浓度为 10 mg / ml)和 0. 5 ml 0. 2 mol / L MES,调 pH 至 5. 6,加入干粉 EDC(浓度为 0. 05 mol / L)室温反应 6 h,期间用 0. 05 mol / L HCl 调 pH 至 5. 6;以0. 01 mol / L PBS,pH 7. 4 作为透析缓冲液,透析偶联产物,过夜。偶联产物经 7. 5% SDS-PAGE 分析。
 1. 6 动物免疫及杂交瘤细胞株的筛选 将完全抗原与 50%弗氏完全佐剂充分乳化,免疫 3 只 BALB / c鼠,经腹腔注射,初免剂量为 100 μg / 只,间隔 10 d进行再次免疫,100 μg / 只,共免疫 3 针,融合前 3 d加强免疫 1 次,150 μg / 只。经小鼠眼眶采血,分离小鼠抗(NANP)5 多抗血清。无菌取脾脏,按常规杂交瘤融合技术进行脾细胞与 SP2 / 0 骨髓瘤细胞之间的融合,HAT 选择培养基筛选,间接 ELISA 法检测细胞上清,选取强阳性孔细胞克隆化。采用有限稀释法,经 3 ~ 4 次克隆化,获得分泌特异性单克隆抗体的细胞株[9].
 
  1. 7 (NANP)5 单克隆抗体的制备及纯化 在冻存细胞株的同时,扩大培养细胞并收集细胞沉淀,经腹腔注射液体石蜡致敏的 F1 小鼠,10 ~ 14 d 后收集腹水,取单抗腹水各 2 ml,50%饱和硫酸铵沉淀法初步盐析粗提[10].以 2 μg / ml 的(NANP)5 多肽包被后,间接 ELISA 法鉴定腹水及纯化后的单抗效价。
 
  1. 8 抗(NANP)5 单抗的亚类和特异性测定 用 HRP标记的兔抗鼠 IgG、HRP 标记的兔抗鼠 IgA、IgM、IgG、IgG1、IgG2b、IgG3、λ、κ,检测各株单克隆抗体,具体操作按免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒说明书进行。间接 ELISA 法[11]测定各株单克隆抗体饱和浓度的 A450值。将各株饱和浓度的单克隆抗体分别与(NANP)5 及(NANP)5C 多肽、HEV、HBsAg、CNTF及 CSP 蛋白(阳性对照)等抗原板条反应,测定 A450值,设阴性对照(生理盐水)。
 
  2 结 果
 
  2. 1 完全抗原的鉴定 检测结果显示,无论是否进行还原处理,偶联前的载体蛋白(马来酰化 BSA)的电泳结果表现为多个亚基的形式,而偶联产物 BSA-(NANP)5 仅显示 1 个蛋白条带。而在 ADH-EDC 介导的偶联中,偶联产物依然保持了 BSA 原来的亚基形式,但所有蛋白条带均表现为条带扩散的现象,表明载体蛋白被有效地衍生和偶联。见图 1 和图 2.
  
  2. 2 单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选 共获得 10株抗(NANP)5 多肽的单克隆抗体。其中除 6G12 株单克隆抗体利用方法 1 制备外,其余 9 株单克隆抗体均利用方法 2 制备。ELISA 法检测结果显示,10 株单抗效价在 1 ∶ 80 000 ~ 1 ∶ 640 000 之间,见表 1,可用来建立检测(NANP)5 多肽的双抗体夹心方法。
  
  2. 3 单克隆抗体的亚类和特异性 检测结果显示,10 株单克隆抗体均为 IgG1 亚类,轻链类型为 κ。各株单克隆抗体均可被(NANP)5 及 CSP 抗原特异性识别;不能被 HEV、HBsAg、CNTF 抗原识别,A450值与阴性对照相同,见表 2,表明制备的抗(-NANP)5多肽的单克隆抗体具备特异的抗 CSP 蛋白的活性,且非特异性反应少。
  
  3 讨 论
  
  NANP 四肽序列是 CSP 的重要的 B 细胞抗原表位,采用针对 NANP 表位的单抗具有更高的特异性。
 
  多肽-蛋白偶联是一种可用于制备抗疟原虫抗体的简便方法,建立 ELISA 检测方法是进行多肽-蛋白偶联物制备的质控方法,可更好地保证多肽-蛋白偶联物的质量和稳定性,提高了日常恶性疟疾监测及大规模恶性疟疾的流行病调查的技术水平。对于仅具备抗原表位的小分子半抗原而言,与结构较为复杂、相对分子质量较大的载体蛋白偶联形成完整抗原,接种实验动物制备多克隆抗体血清或单克隆抗体是一种经典的研究策略[12].近年来,随着分离方法的改进和生物质谱等高灵敏度的检测方法的介入,蛋白质偶联技术的应用逐渐从基础研究领域向应用科学层面过渡。其中,利用蛋白质间、蛋白质-多糖间偶联技术,已经用于疫苗开发,并已有如伤寒 Vi 多糖蛋白结合疫苗成功上市[13].
 
  EDC 及戊二醛是开发最早、也是目前应用较普及的两种偶联试剂。戊二醛具有两个活性的醛基集团,可与蛋白质分子中胺基、亚胺基、琉基及酞胺基反应,形成分子间及分子内的交联形式,偶联度高,产物的均一性差,常造成偶联蛋白的沉淀现象。相对而言,EDC 介导的蛋白质偶联条件较为温和,偶联度也较低,实验的可控性好[14].反应中,EDC 是通过活化蛋白质中酸性氨基酸的羧基与 ADH 的酰肼基团之间形成酰胺键,构成蛋白质的聚体形式。BSA 与(NANP)5 通过下式进行反应。【1】
 由于该反应是 BSA 的马来酰基团与(NANP)5C多肽中 Cys 的自由状态的巯基反应,反应的定向性和选择性高,相对可控地实现实验预期,获得相对单一的产物。但是,由于载体蛋白和多肽中反应基团的特异性限制,也使反应的效率明显降低,本实验利用方法 1 仅获得 1 株特异的抗(NANP)5 杂交瘤细胞株。而在 ADH-EDC 介导的 BSA 与(NANP)5 多肽偶联中,从理论上,ADH 可衍生 BSA 的 C-端羧基和所有的侧链羧基,ADH 带来的衍生羧基的碳链延长,使 BSA 有利于和小分子的(NANP)5 多肽间进行交联反应。可形成一个 BSA 分子偶联多个(NANP)5多肽的产物,这种结构增加了作为表位的多肽的数量。如此形成的完整抗原免疫小鼠后,可获得更多的抗(NANP)5 多肽的细胞克隆。基于以上原因,考虑到单抗制备过程中阳性克隆筛选时的高通量操作,我们认为 ADH-EDC 介导的载体蛋白和半抗原分子的偶联是以后研究的首选。参考已有的相关研究[16],我们选择了 ADH-碳二亚胺作为偶联试剂。
 
  本实验对获得的 10 株抗(NANP)5 多肽杂交瘤细胞株进行了单抗类别及亚类的鉴定,结果显示,10个细胞株分泌的单抗均为 IgG 类,IgG1 亚类,轻链类型为 κ。腹水的 ELISA 抗体效价在 1 ∶ 80 000 ~1 ∶ 640 000 之间,与 HEV、HBsAg、CNTF 等抗原无交叉反应。本实验在国内外首次获得了针对恶性疟原虫 CSP 上 Asn-Ala-Asn-Pro(NANP)四肽序列的单克隆抗体,但仍需进一步完善及深入研究,为基于CSP 的恶性疟疾疫苗的研发奠定基础。
 

推荐文章

在线客服系统