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CARM1表达与食管癌细胞增殖和迁移相关性的研究

更新时间:2020-10-12 08:17点击:

摘    要:
为探讨共激活相关精氨酸甲基转移酶1(coactivator-associated arginine methyltransferase 1,CARM1)对食管癌细胞增殖和迁移能力的影响,采用免疫组织化学方法检测食管癌组织和癌旁组织中CARM1的表达情况,利用特异的短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)分别敲低食管癌细胞株KYSE510和TE-1中CARM1的表达,通过过表达质粒上调食管癌细胞株KYSE150和ECA9706中CARM1的表达,采用CCK-8生长曲线试验和平板克隆形成试验检测CARM1敲低和上调后的食管癌细胞增殖能力的变化情况,并采用Transwell细胞迁移试验检测细胞迁移能力的变化情况。结果显示,与癌旁组织比较,CARM1蛋白在食管癌组织中高表达(P<0.01);敲低CARM1后食管癌细胞的迁移和增殖能力减弱(P<0.05);过表达CARM1后食管癌细胞的迁移和增殖能力增强(P<0.05)。提示CARM1在促进食管癌细胞生长和恶性肿瘤进展过程中发挥重要作用。
 
关键词:
食管癌; 共激活相关精氨酸甲基转移酶1; 增殖; 迁移;
蛋白质精氨酸甲基转移酶(protein arginine methyltransferase,PRMT)属于一类在哺乳动物中常见的酶类家族,能催化多肽中的精氨酸氮原子发生甲基化。迄今为止已经发现有9个成员,它们有着广泛的生物学功能,涉及细胞信号转导、转录调控、mRNA剪接、DNA修复等过程[1,2]。PRMT4更为人所熟知的名称是共激活相关精氨酸甲基转移酶1 (coactivator-associated arginine methyltransferase 1, CARM1),它最早是通过结合p160类固醇受体共激活剂而被人们所发现。CARM1参与转录、前mRNA剪接、细胞周期和DNA损伤反应等[3,4,5]。已有研究发现,CARM1在多种肿瘤中表达失调,包括结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、骨肉瘤等[6,7,8,9]。然而,CARM1在食管癌中的作用尚未见大量研究。
 
食管癌在我国属于高发的恶性肿瘤之一,五年生存率一直处于较低水平。本研究通过检测食管癌组织中CARM1的表达,并在细胞水平观察CARM1敲低对食管癌细胞增殖及迁移能力的影响,旨在为食管癌的临床治疗提供新的肿瘤标志物。
 
1 材料和方法
1.1 细胞培养
人食管癌细胞株KYSE510、TE-1、ECA9706均由上海交通大学医学院附属新华医院分子生物实验室保存,KYSE150购自中国科学院细胞库,培养于RPMI 1640培养液中;人正常食管上皮细胞HET-1A由上海交通大学医学院附属新华医院分子生物实验室保存,培养于DMEM培养液中,添加10%的FCS(Gibco公司)以及100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。所有细胞均在含5% CO2的37 ℃恒温孵育箱中培养。
 
1.2 质粒转染
采用脂质体转染的方法,在使用转染试剂Lipofectamine 3000转染前1 d,将待转染的细胞按一定的密度接种于6孔板,培养24 h后根据试剂说明书进行质粒转染。其中,干扰CARM1表达采用短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA),所用质粒名称为GV493,靶点序列为CACAACAACCTGATTCCTT;CARM1过表达所用质粒名称为GV146,克隆位点为XhoI / EcoRI,基因序列为NM_199141,长度为199 141 bp。
 
1.3 CCK-8生长曲线试验
在食管癌细胞质粒转染后24 h将细胞消化下来,以3×103 个/孔的密度将细胞接种于96孔板(100 μL/孔),待细胞完全贴壁后加入10 μL CCK-8试剂(Dojindo公司),37 ℃ 5%CO2培养1 h后测定光密度[D(450 nm)]。以24 h为检测间隔,连续检测5 d。
 
1.4 mRNA的检测分析
按照试剂盒说明书提取细胞RNA,用NanoDrop 2000分光光度计检测RNA的浓度和纯度,按TaKaRa反转录试剂盒说明书将RNA合成cDNA,采用TaKaRa荧光定量PCR试剂盒进行CARM1基因检测,以GAPDH为内参。反应条件为:95 ℃预变性30 s,95 ℃变性5 s,60 ℃退火并延伸34 s,共进行40个循环。采用2-△△Ct法分析结果。
 
1.5 Western blotting
裂解细胞收集蛋白,对蛋白进行电泳,经SDS-PAGE凝胶分离后,4℃以 300 mA恒流湿法转膜90 min,室温封闭1 h,4 ℃一抗孵育过夜后用PBST洗3次(10 min/次),之后室温避光孵育二抗1 h,用PBST避光洗3次(10 min/次)。用ODYSSEY红外成像系统扫描聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜。
 
1.6 Transwell细胞迁移试验
对胰蛋白酶消化转染后24 h的细胞进行细胞计数,用含1%FCS的RPMI 1640培养液制备细胞悬液,取500 μL含1×105个细胞的细胞悬液接种于Transwell小室内,在24孔板的孔中加入含有10%FCS的RPMI 1640培养液。37 ℃ 5%CO2培养48 h,擦掉Transwell小室内未穿膜的细胞,用4%的多聚甲醛固定穿过膜的细胞,再用结晶紫染色液染色,在显微镜下观察、拍照,选取5个视野进行计数。
 
1.7 免疫组织化学染色
将组织芯片依次进行二甲苯脱蜡和乙醇梯度脱水(100%、80%、60%),将芯片放入0.1% 枸橼酸溶液中煮沸15 min进行抗原修复,使用山羊血清稀释液室温封闭20 min,一抗孵育1~2 h,PBS 洗涤4次(10 min/次),二抗孵育30 min,PBS洗涤 4次(10 min/次),然后进行二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)显色和苏木精复染,乙醇梯度脱水,二甲苯透明,滴加中性树脂封片。
 
1.8 平板克隆形成试验
取生长状态良好的对数期细胞进行消化计数,以每孔7 000个细胞接种于6孔板中。在细胞培养箱中持续培养2~3周后取出培养液,用PBS洗涤3次,使用4%的多聚甲醛固定液固定细胞10 min,去除固定液,用PBS清洗3次,用结晶紫溶液染色30 min,PBS洗涤后风干,拍照并记录,计算所形成的细胞克隆数。
 
1.9 统计学处理
所有数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析,计量资料以x¯±s表示,两组间比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
 
2 结果
2.1 CARM1在食管癌组织中的表达
对含有87例食管癌患者的癌组织和癌旁组织的蛋白组织芯片(该芯片购于上海芯超生物技术有限公司,附带生存期数据)进行免疫组织化学分析,发现CARM1在食管癌组织中的表达水平较癌旁组织显著升高(P<0.01),且CARM1的表达水平越高,患者生存期越短。此外,CARM1的表达水平随着肿瘤的进展呈现升高的趋势。(图1)
 
 
2.2 CARM1在食管癌细胞中的表达
在食管癌细胞中,用RT-PCR和Western blotting从mRNA和蛋白水平分析了CARM1的表达水平。结果显示,食管癌细胞CARM1的表达水平较正常食管上皮细胞显著升高(P<0.05)。(图2)
 
2.3 敲低CARM1对食管癌细胞体外迁移能力的影响
为了更深入地研究CARM1在食管癌细胞中的作用,本研究对2株CARM1表达相对较高的食管癌细胞株(KYSE510和TE-1)进行shRNA转染。Western blotting 结果显示,转染shRNA后,与阴性对照(short hairpin-negative control, sh-NC)组比较,敲低的CARM1(short hairpin-CARM1,sh-CARM1)组KYSE510和TE-1细胞的CARM1蛋白表达水平明显下降,表明shRNA对CARM1具有良好的敲低效果。利用Transwell细胞迁移试验检测敲低CARM1后食管癌细胞迁移能力的变化。结果显示,敲低CARM1后食管癌细胞的迁移能力显著减弱(P<0.01)。(图3)
 
2.4 敲低CARM1对食管癌细胞体外增殖能力的影响
通过平板克隆形成试验、CCK-8生长曲线试验检测敲低CARM1对食管癌细胞增殖能力的影响。结果显示,与sh-NC组比较,敲低CARM1后食管癌细胞的增殖能力明显减弱(P<0.05)。(图4、图5)




2.5 过表达CARM1对食管癌细胞迁移能力的影响
为进一步验证CARM1对食管癌细胞的作用,本研究选取了另外2株CARM1表达相对较低的食管癌细胞株ECA9706、KYSE150进行CARM1过表达质粒的转染。Western blotting结果显示,与阴性对照(negative control,NC)组比较,转染过表达质粒后,过表达组ECA9706和KYSE150细胞中CARM1蛋白表达水平明显增强,证明本研究的过表达质粒转染是有效的。同样通过Transwell细胞迁移试验检测过表达CARM1对食管癌细胞迁移能力的影响。结果显示,与NC组比较,过表达CARM1后食管癌细胞的迁移能力明显增强(P<0.05)。(图6)

2.6 过表达CARM1对食管癌细胞增殖能力的影响
CCK-8生长曲线试验结果显示,与NC组比较,CARM1过表达组的细胞增殖能力明显增强(P<0.05)。平板克隆形成试验结果显示,CARM1过表达组食管癌细胞形成的细胞克隆数较NC组显著增多(P<0.05)。进一步验证了CARM1可促进食管癌细胞的增殖。(图7)
3 讨论
在我国,食管癌的发病率居第6位,死亡率居第4位[10],发病类型主要是食管鳞状细胞癌。虽然随着医疗技术的提高,我国食管癌的五年生存率有了一定的提高,但仍处在10%~30%的较低水平[11]。其主要原因是肿瘤的转移与复发,因此,阐明肿瘤迁移与增殖的分子生物学机制尤为重要。
 
CARM1属于Ⅰ型PRMT,其涉及细胞自噬、mRNA剪接、DNA修复和表观遗传调控。已有研究发现,CARM1在许多恶性肿瘤中过表达,且能反式激活许多恶性肿瘤相关转录因子,如p53[12]、E2F相关转录因子1(E2F transcription factor 1,E2F1)[13]、雄激素受体[14]和雌激素受体α[9]。有研究发现,CARM1在骨肉瘤中过表达,且可通过磷酸化糖原合成酶激酶3β/β-连环蛋白/细胞周期蛋白D1信号通路促进人骨肉瘤细胞的增殖[8]。Frietze等[13]发现,CARM1通过上调E2F1促进雌激素刺激的乳腺癌细胞的生长。然而,CARM1与食管癌的关系尚未明确。
 
本研究首先通过免疫组织化学分析对食管癌组织芯片的CARM1表达水平进行检测,发现食管癌组织中CARM1蛋白的表达水平较癌旁组织显著升高,并且在食管癌细胞中CARM1 mRNA和蛋白水平较人正常食管上皮细胞明显升高。为了进一步探讨CARM1对食管癌细胞生物学功能的影响,本研究进行了一系列的体外试验。利用shRNA对食管癌细胞中的CARM1表达水平进行敲低,发现敲低CARM1后的细胞与sh-NC组相比其迁移能力以及增殖能力均明显减弱。因而本研究又对食管癌细胞中的CARM1进行过表达来进一步验证CARM1的作用。结果表明,过表达后食管癌细胞的迁移和增殖能力显著增强。由此可以证明,CARM1在食管癌细胞中扮演着癌基因的角色。但CARM1是通过怎样的机制影响细胞的增殖和迁移能力,又是通过怎样的信号通路发挥作用的呢?我们将对这些问题进行进一步研究。
 
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