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基于免疫学的微生物快速检测技术研究与应用现状

更新时间:2020-11-09 08:36点击:

摘    要:
病原微生物严重威胁着人类健康,公共卫生安全对微生物检测技术提出简便、快速、灵敏、特异的要求。本文系统地介绍了基于免疫学的病原微生物快速检测技术方法,并分析这些技术方法在公共卫生领域的应用现状。
 
关键词:
免疫学 微生物 快速检测
近年来,SARS、H7N9等事件对公众造成一定程度的健康危害和社会恐慌,病原微生物传播速度快、范围广、难监测,在短时间内爆发疫情,严重威胁人类生命健康[1]。院内感染、灾后疫情、集中空调通风系统军团菌病等威胁引起广泛关注[2-4]。为保障人民群众生命健康,公共卫生监测和卫生健康监督机构需要对医院、商场、宾馆、游泳馆等公共场所的空气、水质、用品用具的微生物指标进行现场快速检测,以防止病原菌对公众健康造成危害。传统的微生物培养、分离检测技术存在诸多缺陷,免疫学检测技术灵敏度高、特异性强、方便、快速,在公共卫生安全检测中发挥了重要作用。本文就基于免疫学的微生物快速检测技术进行综述,并分析这些技术在公共卫生监测和监督领域的应用情况。
 
1 基于免疫学的微生物快速检测技术
1.1 免疫荧光技术
免疫荧光技术(Immune Fluorescence Assay,IFA)是指应用抗原抗体相结合的生物反应与形态学相结合的原理,把血清学特异性、荧光色素的敏感性和显微镜检查法融为一体。免疫荧光技术包括荧光免疫测定和荧光抗体染色两种类型,该技术特异性强、快速简便、灵敏度高、费用低,是微生物快速诊断的重要手段。艾春英[5]发现免疫荧光法能够快速检测病毒感染种类且敏感性高。黄愈玲等[6]利用免疫荧光法检出食品沙门氏菌的阳性率与国标法差异无统计学意义。免疫荧光法可直接检测某些含菌浓度较高的样品和具有免疫学及形态学特征的微生物,例如大肠杆菌、军团菌、流感病毒、隐孢子虫和贾第鞭毛虫等[7]。
 
1.2 酶联免疫吸附技术
酶联免疫吸附技术(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)基本原理是用酶标记抗体,将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面,使抗原抗体反应在固相载体表面进行,用洗涤法将液相中的游离成分洗除,通过酶作用于底物显色来判断结果。颜色的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比,显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定。ELISA技术已广泛用于细菌、真菌、病毒和寄生虫的快速检测。研究者采用ELISA对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌、禽流感病毒进行了快速检测研究[8-9]。ELISA简便易操作、没有同位素及放射性污染,试剂可长时间保存。ELI-SA局限性在于结果受不明因子干扰,出现假阳性与假阴性,难于分析检测不稳定的化合物和分子量较小的化合物,不能同时分析检测多种成分。ELISA试剂盒不断涌现,加快了该技术商业化和标准化进程。
 
1.3 化学发光免疫技术
化学发光免疫技术(Chemiluminescence Immunoassay,CLIA)基本原理同酶标记分析法,是用化学发光反应的试剂标记抗原或抗体,与待测物经过一系列免疫反应和理化步骤,最后以测定发光强度来测定待测物。该技术特异性强、灵敏度高、线性范围广、设备要求简单、操作方便、易实现自动化,已广泛应用于微生物快速检测。研究者采用CLIA快速检出了食品中的大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌以及李斯特单胞菌[10]。微型智能化是CLIA的发展方向,提高检测的灵敏度、准确度、速度及其使用率是该技术应用推广的重点。
 
1.4 放射免疫技术
放射免疫技术(Radio Immunoassay,RIA)是将具有高灵敏度的放射性核素示踪技术和特异性免疫化学技术相结合而建立的免疫分析技术。其原理是通过对已经标记的抗原抗体、特异性抗体和待测抗原充分结合反应之后产生的高质量的抗原抗体复合物进行分离,并测定其放射性。RIA具有高灵敏性、特异性、样品量少,成本低的特点,具有一定生命力。但RIA较难自动化,试剂盒有效期较短,一定程度上限制了发展和应用。
 
1.5 免疫胶体金技术
免疫胶体金技术(Immune Colloidal Gold Technique,ICG)是一种是以胶体金为标记物,利用特异性抗原抗体反应,对抗原或抗体物质进行定位、定性乃至定量检测的技术,是继荧光素、放射性同位素和酶标记技术后发展起来的固相标记免疫检测技术。ICG标记物制备简便,不存在内源酶干扰,避免了酶底物潜在致癌风险和放射性同位素污染。ICG具有方便快捷、特异敏感、稳定性强、无需特殊设备和试剂、结果直观等优点,适于野外作业、现场检测等,在公共卫生检测、卫生监督等领域日益广泛应用。研究者们利用ICG快速检测沙门氏菌、流感病毒[11-12]。但由于ICG为定性反应,难以量化,与其他免疫标记方法相比,缺乏严密的质控体系,仅局限为一种粗筛方法。近年来,新型纳米材料如氧化石墨烯、Fe3O4纳米粒子已被用作免疫试纸条的颜色探针,这些探针与免疫胶体金结合可以实现超灵敏的检测,为免疫胶体金技术注入了生命力。
 
1.6 免疫磁珠分离技术
免疫磁珠分离技术(Immunom Agnetic Separation Techniques,IMS)是将免疫学反应的高度特异性与磁珠特有的磁响应性相结合的一种新的、快速、简便的免疫学技术,该技术特异性强、灵敏度高,能够有效分离纯化环境样品中的细菌、病毒和原虫等。研究者们通过免疫磁珠分析了样品中的沙门氏伤寒杆菌、E.coli O157:H7、H9亚型禽流感病毒[13-15]。目前国内外已有多个标准检测方法采用了IMS法[16],且已有商品化的试剂盒用于沙门氏菌、军团菌的检测,可见IMS在微生物检测方面有良好的应用前景。
 
1.7 免疫印迹技术
免疫印迹技术(Immunoblotting Technique)又称蛋白免疫印迹技术,是一种将凝胶电泳和免疫分析技术有机融为一体的分析技术,该方法综合了SDS PAGE的高分辨率及ELISA的高敏感性和特异性,是一种有效的分析手段,现已广泛应用于生物医学检测领域。研究者采用免疫印迹技术检测了幽门螺杆菌、畜禽疫病病原菌[17-18]。
 
1.8 蛋白质芯片技术
蛋白质芯片技术(Protein Chip)是对固相载体进行特殊化学处理,将已知的大量蛋白质有规律地固定其上,根据这些生物分子的特性,捕获能与之特异性结合的待测蛋白,然后用激光扫描仪系统或电感耦合器件获取数组图像,最后用专门计算机软件进行结果分析。该技术是一种高通量的检测技术,灵敏度高、样品量极少。Howell等[19]采用蛋白质芯片技术检测了大肠杆菌和肾沙门氏杆菌。随着蛋白质纯化技术进一步发展和高性能蛋白质分子的产生,蛋白质芯片技术正不断走向成熟。
 
1.9 核酸适配体技术
核酸适配体技术是指通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)体外筛选能与靶标高亲和性和高特异性结合的核糖核酸和单链脱氧核糖核酸。它通常由几十个核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸组成。核酸适配体作用的靶标范围很广,包括小分子、生物大分子(蛋白质和酶)、细菌等。理论上,任何细菌都可能通过SELEX方法筛选到其适配体。目前已有许多关于细菌适配体的筛选及其用于细菌检测的报道,王宇田等[20]报道了基于核酸适配体表面增强拉曼技术(SERS)能够快速检测大肠埃希菌O157:H7。目前细菌适配体还不能满足实际应用的需要,仍有较大发展空间[21]。
 
2 展望
随着人们对健康需求的日益增长,卫生监督、卫生监测、突发公共卫生事件处置和重大活动保障工作中都亟需微生物快检技术,以便捷、快速、高效地应对微生物风险因素。随着科技发展,越来越多的微生物快检技术被研发出来的成效被广泛应用,基于免疫学的微生物快检技术逐渐成为公共卫生安全领域卫生监测、执法和保障的有力工具。利用这些免疫学快速检测技术,人们可以对公共场所、医院、水质、食品等样本中可疑微生物进行现场快速监测,掌握致病菌的数量和代谢动态,从而采取相应防治措施,做到防患于未然。但由于技术和政策局限,微生物快速检测技术体系尚不完善,在现有技术条件下,突破专业和行业局限、挖掘和引进微生物快检技术,形成公共卫生安全领域的微生物现场快检技术体系,使其发挥更大的作用是对我们今后工作的重点内容。
 
参考文献
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