27医学论文范文网

主页
分享医学论文范文

过表达Tapasin树突状细胞来源外泌体诱导T细胞分化的实验研究

更新时间:2020-12-25 08:23点击:

  摘    要:
  
  目的:探讨过表达Tapasin的小鼠骨髓树突状细胞(DCs)来源外泌体在诱导小鼠脾脏T淋巴细胞分化中的作用。方法:构建过表达Tapasin病毒转染至DCs,流式细胞术鉴定CD11c和GFP表达,超高速离心法分离DCs来源外泌体(Dexs)和转染上述病毒的DCs来源外泌体(Tap-Dexs),电镜、粒径分析和Western blot鉴定,并与T淋巴细胞共培养,CCK8法和ELISA法分别检测T淋巴细胞增殖和分泌IFN-γ和IL-2水平。结果:与Dexs相比,Tap-Dexs能显著促进T淋巴细胞增殖、Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2分泌。结论:Tap-Dexs能促进小鼠脾脏T淋巴细胞增殖和诱导T细胞分化。
  
  关键词:
  
  Tapasin 树突状细胞 外泌体 T细胞分化
  
  T细胞是功能最复杂、数量最多的淋巴细胞,主要参与体内细胞免疫,可通过细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocytes,CTLs)反应直接杀伤靶细胞,也可通过分泌细胞因子增强细胞免疫[1]。T细胞免疫疗法在抗感染、肿瘤治疗方面具有重要作用,调节T细胞免疫可增强抗感染和抗肿瘤免疫,从而促进其对病毒性和免疫性疾病的治疗作用[2,3]。
  
  Tapasin是参与内质网腔中HLA Ⅰ类分子装配的重要蛋白,是主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ类抗原呈递途径的关键组成部分,参与T细胞免疫过程[4]。树突状细胞(dendritic cells,DCs)是体内功能最强的抗原提呈细胞,通过共刺激分子和MHC分子识别和呈递抗原至T细胞介导细胞免疫反应,阻断DC相关通路可抑制T细胞免疫应答[5-7]。
  
  外泌体是核内体与质膜融合形成的纳米级囊泡,能在细胞间传递信息物质[8]。大部分细胞都能分泌外泌体,不同细胞分泌的外泌体既有其共性,如表达CD9、CD63等,也有其自身特性,如DCs来源外泌体表达MHC分子,有效激活T细胞,诱导抗原特异性T细胞反应,同时促进IFN-γ产生[9,10]。IFN-γ是活化的T细胞分泌的一种细胞因子,可激活机体多种免疫细胞,参与免疫调节,增强机体免疫应答。新近研究发现产生IFN-γ的CD4+T细胞有利于HBV病毒的清除[11]。
  
  本研究分离过表达Tapasin的小鼠骨髓来源DCs分泌的外泌体与T细胞在体外相互作用,发现转染病毒的DCs来源外泌体(Tap-Dexs)能促进T细胞增殖并诱导其分化,促进T细胞免疫反应,有望在免疫相关疾病治疗中发挥重要作用。
  
  1 材料与方法
  
  1.1 材料
  
  6~8周龄雌性C57BL/6小鼠购自上海市第六人民医院动物房;粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-4、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)购自Peprotech公司;CD11c(Ms CD11c BV421 N418 5 μg)购自BD Pharmingen公司;无外泌体血清购自SBI;RPMI1640购自Hyclone;HSP90、CD9抗体购自Abcam公司;CD3 Monoclonal Antibody、 CD28 Monoclonal Antibody、Cell Stimulation Cocktail(plus protein transport inhibitors,500X) 购自eBioscience公司;丝裂霉素C购自Sigma公司;IFN-γ和IL-2 ELISA试剂盒购自美国R&D公司;HBcAg(18-27)购自上海吉尔公司。
  
  1.2 方法
  
  1.2.1 小鼠骨髓DCs的分离、培养及鉴定
  
  将C57BL/6小鼠脱颈处死取胫、股骨骨髓液于15 ml离心管,加入红细胞裂解液静置5 min后1 100 r/min离心5 min,PBS洗涤后用含血清的RPMI1640培养基重悬,加入GM-CSF(20 ng/ml)、IL-4(10 ng/ml)培养约3 d获得DCs。收集上述细胞沉淀,用 50 μl经过滤的PBS重悬,加入3 μl CD11c抗体,室温避光孵育30 min,PBS洗3次,流式细胞术检测表达。
  
  1.2.2 构建过表达Tapasin的病毒并转染至DCs
  
  从GenBank中查询目的基因及其上下游序列,设计引物。根据分子克隆方法通过PCR扩增获得目的基因Tapasin,用限制性内切酶对表达载体pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3Flag进行酶切,无缝克隆试剂盒将Tapasin构建入表达载体,使用DH5α感受态细胞转化、铺菌,使用小剂量质粒抽提试剂盒扩增质粒pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-Tapasin-3Flag,引物序列为CMV-F:5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′,并比对目的基因和Tapasin序列。将上述质粒转染至293T细胞获得过表达Tapasin的病毒,并检测病毒滴度为2.59×108。按照病毒手册操作转染至上述分离的DCs,转染步骤:细胞以1×105个/孔铺于96孔板,按照MOI=20加入相应病毒,混匀,将96孔板密封,于平角离心机1 000 g 离心1 h后继续放入培养箱培养,8 h 后换新鲜培养基,48、72 h后荧光显微镜下观察荧光,流式细胞术分析GFP荧光表达情况。
  
  1.2.3 DC来源外泌体的提取
  
  用无外泌体血清加RPMI1640培养转染和未转染Tapasin病毒的DCs 48 h 后收集细胞上清,300 g 离心10 min去除漂浮细胞,弃沉淀继续2 000 g离心10 min去除死细胞和脱落囊泡,取上清10 000 g离心30 min去除细胞碎片、脱落囊泡和凋亡小体,继续取上清140 000 g离心70 min使外泌体和污染的蛋白沉淀,弃上清,PBS重悬,140 000 g离心70 min去除污染蛋白,所得沉淀即为外泌体,即Tap-Dexs和Dexs。
  
  1.2.4 电镜观察成熟DC来源外泌体
  
  10 μl PBS稀释10 μl分离纯化的外泌体,滴加于2 mm载样铜网,室温静置1 min,用滤纸吸去多余液体,3%(W/V)磷钨酸钠溶液室温复染1 min,双蒸水清洗后晾干,透射电子显微镜观察外泌体并拍照。
  
  1.2.5 纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)
  
  1 ml经过滤的PBS重悬分离纯化的外泌体沉淀, 缓慢加入Zetaview仪器进行检测,追踪和分析每个颗粒的布朗运动,分析颗粒的直径和浓度并保存分析数据。
  
  1.2.6 Western blot检测外泌体相关蛋白表达
  
  取一定量分离纯化外泌体加入RIPA裂解液裂解后提取外泌体总蛋白,采用BCA法测定蛋白浓度,加入适当比例上样缓冲液于100℃煮沸10 min使蛋白变性。采用PAGE凝胶快速制备试剂盒分别配制6%和10%分离胶和浓缩胶进行SDS-PAGE电泳分离,通过转膜液将目的蛋白和内参转移至PVDF 膜,5% 脱脂奶粉室温摇床封闭1 h,加入兔抗鼠一抗(Flag 1∶1 000;CD9 1∶1 000;β-actin 1∶1 000)4℃摇床过夜,回收一抗,PBS洗涤3次,每次10 min,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(1∶5 000),室温孵育1 h,回收二抗,PBS洗涤3次,每次10 min,加入ECL液于化学发光成像系统中曝光显影。
  
  1.2.7 T细胞的分离及培养
  
  C57BL/6小鼠脾脏研磨后加入淋巴细胞分离液,2 200 r/min离心20 min,吸取4层分层中的第2层白膜,PBS洗涤后重悬,滴入尼龙毛柱中于37℃细胞恒温培养箱中垂直静置1 h,收集流出液离心后重悬即为T淋巴细胞。加入CD3(0.5 μg/ml)包被6孔板4℃过夜,加入上述得到的T细胞悬液并加入CD28(0.5 ng/ml)激活T细胞,于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养。
  
  1.2.8 CCK8法检测外泌体对T细胞增殖的影响
  
  小鼠骨髓DC加HBcAg 10 μg/ml(作为抗原激活DCs使其发挥功能)于细胞培养箱孵育 24 h,将上述激活的T细胞与DCs(铺板前用25 μg/ml丝裂霉素C刺激30 min抑制DCs增殖)按照5∶1、10∶1、20∶1的比例铺于96孔板,分别加入培养基、Dexs、Tap-Dexs培养12 h后加入10 μl CCK8试剂,2 h 后于酶标仪检测450 nm波长下OD值,计算平均值。
  
  1.2.9 ELISA法检测外泌体对T细胞分泌IFN-γ和IL-2的影响
  
  按1.2.7的方法提取小鼠脾脏T细胞,实验组加入10 μg/ml Tap-Dexs,阳性对照组加入10 μg/ml Dexs,加入培养基作为阴性对照组,共培养24 h后收集细胞上清,按照ELISA试剂盒说明书检测T细胞分泌IFN-γ和IL-2水平,计算平均值。
  
  1.3 统计学分析
  
  应用统计学软件GraphPad Prism 5进行数据分析。实验数据采用x¯±s表示,两组间比较采用t检验,以P<0.05 为差异有统计学意义。
  
  2 结果
  
  2.1 DC的培养、诱导和鉴定
  
  第1天可见细胞小而圆,比较分散,第3天可见细胞聚集成团(图1A)。流式细胞术分析显示,CD11c表达率为42.07%(图1B),表明DCs诱导成功。
  
  2.2 过表达Tapasin病毒的构建及转染DCs
  
  构建病毒pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-Tapasin-3Flag(图2A),测序对比目的基因和Tapasin序列一致。将上述构建病毒转染至DCs,荧光显微镜下观察荧光,可见绿色荧光(图2B),流式细胞术分析显示GFP表达率为86.99%,表明转染成功(图2C)。
  
 
  
  Fig.2 Construction of virus overexpressing Tapasin and fluorescence and GFP expressions after transfect it to DCs
  
  2.3 DC来源外泌体的提取和鉴定
  
  通过电镜观察外泌体的形态呈圆形或椭圆形,可见数个小囊泡即为外泌体(图3A), NTA粒径分析外泌体大小为100~150 nm(图3B),Western blot检测其蛋白Tapasin和CD9表达如图3C。Dexs和Tap-Dexs在大小和形态上以及外泌体标志物方面差异无统计学意义,Tap-Dexs可表达Tapasin,而Dexs不表达Tapasin,表明Tapasin仅存在于Tap-Dexs中,提示Tapasin病毒转染成功。
  
  2.4 DC来源外泌体对T细胞增殖的影响
  
  结果表明Tap-Dexs促进T细胞增殖的能力优于Dexs(图4, P<0.01), 验证了Tapasin在 T 细胞方面的作用。
  
  2.5 DC来源外泌体对T淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-2的影响
  
  结果表明Tap-Dexs能促进T细胞分泌IFN-γ和IL-2,比Dexs的作用更强(图5,P<0.05),提示Tapasin能促进T细胞向Th1方向分化。
 
  
  Fig.5 Expression levels of IFN-γ and IL-2 detected by ELISA
  
  3 讨论
  
  近年来,外泌体成为研究热点,其通过传递细胞内的物质(如蛋白质和核酸)或通过表面的受体与效应细胞发生作用参与细胞间的信息传递[12]。通过改变母细胞状态可改变外泌体的特性从而使外泌体向特定的方向发展。研究发现Tapasin能促进抗原呈递,增强CD8+CTLs对肿瘤免疫的识别和破坏作用,同时Tapasin表达的降低与结直肠癌的进展有关[13]。Tapasin在T细胞免疫中起重要作用。本研究通过将Tapasin病毒转染至DCs使其表达Tapasin,提取其分泌的外泌体,使外泌体表达Tapasin,验证其对T细胞分化的影响。富含AFP的DC来源外泌体在肝细胞癌小鼠体内表达明显上升,表达IFN-γ和IL-2的CD8+T细胞数量增加,改变小鼠的免疫微环境,增强小鼠免疫应答,发挥抗肿瘤免疫作用[14]。免疫细胞如DC、巨噬细胞等来源的外泌体在免疫研究领域具有重要价值[15]。DC来源外泌体能进入小鼠脾脏,被CD4+T细胞摄取,通过内分泌机制激活T细胞,同时趋化因子和炎症细胞因子IFN-γ和IL-2表达上升,改善小鼠心脏功能[16]。课题组前期研究表明含Tapasin的肽段CTP-HBcAg18-27-Tapasin可通过JAK/STAT通路诱导T淋巴细胞向Th1分化[17]。
  
  本研究发现,在体外,小鼠骨髓DC来源外泌体能促进T细胞增殖和Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2分泌,增强免疫应答,在免疫性疾病的治疗中具有重要意义,但还需进一步验证DC来源外泌体在小鼠体内的作用以及外泌体促进T细胞增殖和诱导T细胞分化的机制。进一步研究DC来源外泌体对T细胞功能的影响将有助于免疫相关性疾病的治疗。
  
  参考文献
  
  [1] Golstein P,Griffiths GM.An early history of T cell-mediated cytotoxicity[J].Nat Rev Immunol,2018,18(8):527-535.
  
  [2] Tkach M,Kowal J,Zucchetti AE,et al.Qualitative differences in T-cell activation by dendritic cell-derived extracellular vesicle subtypes[J].EMBO J,2017,36(20):3012-3028.
  
  [3] Leitman EM,Willberg CB,Tsai MH,et al.HLA-B*14:02-restricted env-specific CD8(+) T-cell activity has highly potent antiviral efficacy associated with immune control of HIV infection[J].J Virol,2017,91(22):e00544-17.
  
  [4] Thuring C,Follin E,Geironson L,et al.HLA class Ⅰ is most tightly linked to levels of tapasin compared with other antigen-processing proteins in glioblastoma[J].Br J Cancer,2015,113(6):952-962.
  
  [5] Huo FF,Li DB,Zhao B,et al.Deficiency of autoimmune regulator impairs the immune tolerance effect of bone marrow-derived dendritic cells in mice[J].Autoimmunity,2018,51(1):10-17.
  
  [6] Bigley V,Barge D,Collin M.Dendritic cell analysis in primary immunodeficiency[J].Curr Opin Allergy Clin Immunol,2016,16(6):530-540.
  
  [7] 张延梅,严瑞明,丁玫琳,等.树突状细胞TLR2阻断抑制自身免疫性糖尿病研究[J].中国免疫学杂志,2019,35(8):902-905,911.Zhang YM,Yan RM,Ding ML,et al.TLR2 blockade on dendritic cell inhibits autoimmune diabetes[J].Chin J Immunol,2019,35(8):902-905,911.
  
  [8] Fu M,Gu J,Jiang P,et al.Exosomes in gastric cancer:Roles,mechanisms,and applications[J].Mol Cancer,2019,18(1):41.
  
  [9] Kouwaki T,Fukushima Y,Daito T,et al.Extracellular vesicles including exosomes regulate innate immune responses to hepatitis b virus infection[J].Front Immunol,2016,7:335.
  
  [10] Wahlund CJE,Güclüler G,Hiltbrunner S,et al.Exosomes from antigen-pulsed dendritic cells induce stronger antigen-specific immune responses than microvesicles in vivo[J].Sci Rep,2017,7(1):17095.
  
  [11] Wang H,Luo H,Wan X,et al.TNF-alpha/IFN-gamma profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection[J].J Hepatol,2020,72(1):45-56.
  
  [12] Mathieu M,Martin-Jaular L,Lavien G,et al.Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication[J].Nat Cell Biol,2019,21(1):9-17.
  
  [13] Sokol L,Koelzer VH,Rau TT,et al.Loss of tapasin correlates with diminished CD8(+) T-cell immunity and prognosis in colorectal cancer[J].J Transl Med,2015,13:279.
  
  [14] Lu Z,Zuo BF,Jiang RW,et al.Dendritic cell-derived exosomes elicit tumor regression in autochthonous hepatocellular carcinoma mouse models[J].J Hepatol,2017,67(4):739-748.
  
  [15] 刘满宇,付璐,张文慧,等.免疫细胞与外泌体相互作用机制的研究进展[J].中国免疫学杂志,2019,35(22):2806-2812.Liu MY,Fu L,Zhang WH,et al.Progress in mechanism of interaction between immune cells and exosomes[J].Chin J Immunol,2019,35(22):2806-2812.
  
  [16] Liu H,Gao W,Yuan J,et al.Exosomes derived from dendritic cells improve cardiac function via activation of CD4(+) T lymphocytes after myocardial infarction[J].J Mol Cell Cardiol,2016,91:123-133.
  
  [17] Wu S,Chen XH,Tang YY,et al.Delivery of tapasin-modified CTL epitope peptide via cytoplasmic transduction peptide induces CTLs by JAK/STAT signaling pathway in vivo[J].Acta Biochem Biophys Sin(Shanghai),2018,50(2):181-190.

推荐文章

在线客服