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DAAs治愈的初治型慢性丙型肝炎患者T细胞免疫学特点

更新时间:2021-01-11 08:58点击:

  史继静 周文靖 李元元 常文仙 贾晓燕 张纪元 王福生
  
  
  郑州市第一人民医院中心实验室 中国人民解放军总医院第五医学中心感染性疾病诊疗与研究中心
  
  
  摘    要:
  
  
  目的 探讨使用直接抗病毒药物(direct-acting antivirals, DAAs)治愈的初治型慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C, CHC)患者的T细胞免疫学特点及变化。方法 选择2015年9月—2017年1月中国人民解放军总医院第五医学中心(原解放军第三〇二医院)采用达拉他韦(daclatasvir, DCV)和阿舒瑞韦(asunaprevir, ASV)治愈的13例初治型CHC患者为研究对象,13例健康者为健康对照组。采用流式细胞术检测健康者以及CHC患者治疗前、治疗第24周及治疗结束后(随访第4周、第12周、第24周)外周血中T细胞的表型和功能特征。结果 与健康对照组相比,CHC患者治疗前T细胞、CD4+T细胞及CD8+T细胞PD1的表达显著增高(P均<0.05);T细胞及CD8+T细胞CD3ζ平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI)明显降低(P均<0.05);CD4+T细胞CD3ζMFI降低,但差异无统计学意义(P> 0.05)。与治疗前相比,DCV/ASV治疗第24周时及随访期,CHC患者外周血T细胞及CD4+T细胞、CD8+T细胞的频率、PD1的表达、CD3ζMFI均无明显变化;效应记忆型T细胞在总T细胞、CD4+T细胞及CD8+T细胞中的比例无明显变化;CD8+T细胞中CXCR5+CD8+T比例有增高趋势,但差异无统计学意义(P均> 0.05)。结论 DCV/ASV治愈的初治型HCV-1b型CHC患者,外周血T细胞表型和功能未发生显著改善。
  
  
  关键词:
  
  
  慢性丙型肝炎 T细胞 直接抗病毒药物
  
  
  丙型肝炎是由HCV感染引起的一种传染性疾病,严重威害人类健康。目前,全球HCV感染者多于1.8亿,中国约0.13亿[1],仅20%~30%的急性感染者可自发清除体内病毒,约80%感染者会逐渐发展为慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C,CHC),逐渐进展为肝纤维化、肝硬化,部分甚至进展至肝癌,每年因该病死亡的人数可高达39 000人[2]。研究表明,HCV感染者的转归与其机体免疫应答水平密切相关,强烈、持久的多特异性HCV特异性T细胞免疫应答利于病毒的清除,较弱、短暂的免疫应答易造成持续感染[3]。
  
  
  目前,直接抗病毒药物(direct-acting antivirals,DAAs)的应用给HCV感染的治疗带来革命性进展,因其具有高治愈率、低毒、短疗程等优点,被国际指南推荐,并取代Peg-IFN-α联合利巴韦林,成为治疗CHC的一线方案[4-6]。有关DAAs治疗前后CHC患者免疫功能变化的研究不少,但治疗后患者体内HCV特异性T细胞免疫功能是否恢复尚存在争议。本研究以DAAs治愈的初治型CHC患者(基因型为HCV-1b)为研究对象,分析患者治疗及随访过程中T细胞表型及功能变化,以进一步探讨DAAs治疗对初治型CHC患者T细胞免疫学功能特点的影响。
  
  
  1 对象与方法
  
  
  1.1 对象
  
  
  入选病例为2015年9月—2017年1月中国人民解放军总医院第五医学中心(原解放军第三〇二医院)治愈的13例初治型CHC患者,病毒基因型为HCV-1b。初治定义:患者确诊后未接受任何干扰素制剂(IFN-α、Peg-IFN-α)、利巴韦林(ribavirin,RBV)和DAAs(蛋白酶抑制剂、聚合酶抑制剂、NS5A抑制剂等)治疗。纳入标准:(1)年龄≥18岁;(2)仅HCV-1b型感染;(3)入组时患者的HCV RNA≥104 IU/ml;(4) HBs Ag和HIV-1均为阴性。排除标准:(1)除HCV以外的疾病所导致的慢性失代偿性肝病,包括但不限于腹水、静脉曲张出血或肝性脑病;(2)确诊或疑似肝细胞癌或其他恶性肿瘤;(3) TBIL≥2 mg/dl(34μmol/L);(4) ALT≥5倍正常上限;(5)白蛋白<3.5 g/dl(35 g/L);(6) AFP>100 ng/ml(82.6 IU/ml)或AFP≥50 ng/ml且≤100 ng/ml(≥41.3 IU/ml且≤82.6 IU/ml)的受试者须进行肝脏超声检查,如有疑似肝细胞癌则应排除;(7) HGB<8.5 g/dl(85 g/L);(8)中性粒细胞绝对数<0.5×109/L;(9) PLT<50×109/L;(10)未受控制的糖尿病或高血压患者;11中、重度抑郁症患者。所有入组患者均采用达拉他韦(daclatasvir,DCV)和阿舒瑞韦(asunaprevir,ASV)2种药物治疗24周,治疗后随访24周,以随访结束时HCV RNA仍检测不到判定为持续病毒学应答(sustained virologic response,SVR)。分别于治疗前、治疗第1周、第2周、第4周、第6周、第8周、第12周、第24周,治疗结束后随访第4周、第12周、第24周时留取患者外周静脉血标本。同时入组13例健康者为健康对照(healthy control,HC)组,并留取外周静脉血标本,其年龄、性别均与CHC组患者相匹配(表1)。该研究通过中国人民解放军总医院第五医学中心伦理委员会审核,所有研究对象均签署书面知情同意书。
  
  
  1.2 材料
  
  
  本研究用主要流式抗体如下:小鼠抗人CD3-BV510、CD3-BV421、CD8-Percp cy5.5、C D 3 8-P E-C y 7、P D 1-P E-C y 7、C D 1 6 0-A P C、2B4-APC-H7、CD45RA-BV421、CCR7-FITC等购自Biolegend公司,KLRG1-FITC、CD3ζ-PE购自美国e Bioscience公司,CD8-Percp、CD185-BV421购自美国BD公司。
  
  
  表1 2组基线资料
  
  
  1.3 方法
  
  
  1.3.1 人外周血单个核细胞的分离和冻存
  
  
  EDTA抗凝外周静脉血2000 r/min离心10 min,留取上层血浆后,加入等体积PBS重悬细胞,将重悬后的细胞悬液缓慢加至淋巴细胞分离液上层(细胞悬液与淋巴细胞分离液体积比为2∶1~1∶1),2500 r/min,离心20 min;收集白膜层细胞用PBS离心洗涤2次,1500 r/min,离心5 min,即得到人外周血单个核细胞。用含10%DMSO和90%FBS配制的冻存液将细胞冻存。
  
  
  1.3.2 T细胞表型分子检测
  
  
  37℃水浴锅,快速复苏冻存的人外周血单个核细胞,细胞浓度调整为5×106/ml,取100μl置于5 ml流式管中,加入抗体(CD3、CD8、CD38、CD45RA、CCR7、CD185、PD1、CD160、KLRG1、2B4等),混匀,避光孵育25 min;加入1 ml PBS,混匀,1500 r/min,离心5 min;弃上清,拍干;加破膜剂,200μl/管,室温避光破膜50 min;用破膜洗液离心洗涤,加入胞内抗体CD3ζ,室温避光孵育25 min;破膜洗液离心洗涤,弃上清,拍干;用200μl 1%多聚甲醛液重悬细胞,4℃避光保存,24 h内进行流式检测。
  
  
  1.3.3 统计学处理
  
  
  使用SPSS 21.0统计软件进行数据分析,正态分布的计量资料采用表示,组间差异分析采用t检验;非正态分布的计量资料采用中位数和四分位数表示,组间比较采用MannWhitney U非参数检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
  
  
  2 结果
  
  
  2.1 HCV RNA水平变化
  
  
  化13例DAAs治愈的初治CHC患者治疗前HCV RNA为6.82(4.31,7.29)log IU/ml。DAAs治疗2周后,所有患者HCV RNA水平降至检测下限(HCV RNA<25 IU/ml),并持续到随访结束,实现SVR即为得到治愈[7]。所有入组患者在DAAs治疗及随访期未发生明显的不良反应。
  
  
  2.2外周血中T细胞表型及其亚群变化
  
  
  对外周血T细胞及其亚群占外周血单个核淋巴细胞的比例进行分析发现,与HC组相比,CHC组患者DAAs治疗前外周血中总T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的频率差异无统计学意义(P均>0.05);CHC患者在DAAs治疗前、治疗第24周及随访期,外周血总T细胞及其CD4+T细胞和CD8+T细胞亚群亦无明显变化(P均>0.05)(图1)。
  
  
  2.3 外周血记忆型T细胞分布
  
  
  按照CD45RA和CCR7表达的不同,我们对记忆型T细胞进行了分析,发现DAAs治疗前,CHC组患者外周血效应记忆型T细胞在总T细胞及CD4+T细胞、CD8+T细胞亚群中的比例与HC组相比均无明显差异(P均>0.05),且DAAs治疗并未改变这种趋势;中央记忆型T细胞在总T细胞及CD4+T细胞中的比例与HC组相比差异亦无统计学意义(P均>0.05),但DAAs治疗后随访第12周时在总T细胞中的比例较治疗前明显增高(Z=66.000,P=0.034),DAAs治疗第24周(Z=76.000,P=0.033)、随访第4周(Z=77.500,P=0.025)、随访第12周(Z=76.000,P=0.004)及随访第24周(Z=67.000,P=0.028)时在CD4+T细胞中的比例均较治疗前明显增高;中央记忆型T细胞占CD8+T细胞的比例较HC组明显增高(U=45.000,P=0.046),且DAAs治疗后,随访至第24周时这种变化差异仍有统计学意义(U=45.000,P=0.046)(图2)。
  
  
  2.4 外周血T细胞及其亚群的表型变化
  
  
  外周血T细胞表型分析结果显示:与HC组相比,DAAs治疗前、治疗第24周、随访第4周、随访第12周及随访第24周时CHC组患者外周血T细胞活化分子CD38的表达均无明显差异;抑制性分子PD1的表达,在DAAs治疗前(U=36.000,P=0.014)、治疗第24周(U=42.000,P=0.031)、随访第4周(U=37.000,P=0.016)、随访第12周(U=41.000,P=0.027)及随访第24周(U=32.000,P=0.008)时均显著增高。其他抑制性分子2B4、CD160、KLRG1的表达则无明显差异。DAAs治疗结束后随访第4周(U=8.000,P=0.009)、随访第12周(Z=6.000,P=0.010)及随访第24周(Z=2.500,P=0.004)时,CHC患者外周血T细胞CD38的表达较治疗前均显著降低;抑制性分子PD1、2B4、CD160、KLRG1的表达较治疗前无明显变化(P均>0.05)(图3A)。
  
  
  CD4+T细胞和CD8+T细胞的表型分析结果显示与外周血总T细胞变化趋势一致(图3B~C)。同时发现DAAs治疗结束随访至第12周时CHC患者CD4+T细胞PD1的表达较治疗前显著降低(Z=13.000,P=0.023),但仍高于HC组(U=45.000,P=0.046)(图3B)。
  
  
  2.5 外周血CXCR5+CD8+T细胞的频率分析
  
  
  与HC组相比,CHC组患者外周血CXCR5+CD8+T细胞的频率在DAAs治疗第24周(U=43.000,P=0.036)、随访第4周(U=45.500,P=0.048)及随访第12周(U=33.000,P=0.009)时均显著升高;与治疗前相比,患者在DAAs治疗第24周,以及治疗结束后随访期均未观察到外周血CXCR5+CD8+T细胞频率的明显变化(图4)。
  
  
  2.6 外周血T细胞功能变化
  
  
  对外周血总T细胞CD3ζ表达情况进行分析,结果显示:与HC组相比,CHC组患者DAAs治疗前(U=31.500,P=0.021)、治疗第24周(U=28.000,P=0.012)、随访第4周(U=36.000,P=0.040)、随访第12周(U=23.000,P=0.005)及随访第24周(U=31.500,P=0.021)时外周血总T细胞CD3ζ的平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)均显著降低;与治疗前相比,CHC组患者外周血T细胞CD3ζMFI在DAAs治疗第24周时及随访第4周、第12周、第24周时变化均无统计学意义(P均>0.05)(图5A)。
  
  
  对CHC患者外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞CD3ζ的表达分析,发现患者CD8+T细胞CD3ζ与患者外周血总T细胞CD3ζ变化趋势一致,但患者治疗前CD4+T细胞CD3ζ与HC组相比无显著性变化(图5B~C)。
  
  
  3 讨论
  
  
  HCV具有6种基因型(GT)和多种亚型,GT-1型感染最常见,几乎占全球HCV感染的50%[8]。在我国,约94%~95%的GT-1型感染者为1b型,占全部HCV感染的57%~68%。以往Peg-IFN-α联合RBV治疗GT-1型HCV感染者的血清学病毒应答率仅50%左右[9-10]。DCV/ASV作为国内首个获批的DAAs联合治疗方案,可明显提高HCV-1b型CHC患者的治愈率,且具有更好的安全性和耐受性。本研究中13例接受DCV/ASV治疗24周的HCV 1b型CHC患者均达到SVR。
  
  
  急性HCV感染治愈者体内检测到较强、多表位的针对HCV结构蛋白和非结构蛋白的抗原特异性T细胞,而慢性HCV感染者的T细胞存在不同程度的功能障碍,如高表达多种抑制性受体、低增殖能力、分泌IFN-γ等细胞因子能力以及代谢功能受损等[11]。DAAs在快速清除病毒、实现HCV感染治愈的同时,能否改善患者的T细胞免疫功能尚无定论。自首次报道DAAs治愈的CHC患者体内HCV特异性CD8+T细胞功能得到恢复后[12],后续研究还发现DAAs治疗能够维持HCV特异性CD8+T细胞的记忆特点[13],降低TIGIT等抑制性分子的表达[14]。然而,一些研究报道DAAs治疗并未恢复HCV特异性T细胞的功能,改善线粒体受损状态[8,11]。
  
  
  本研究发现,DAAs治疗前后CHC患者外周血总T细胞、CD4+T细胞及CD8+T细胞的频率均无明显变化。效应记忆型T细胞的比例被认为与HCV感染自发性清除有关,我们进一步分析未观察到记忆型T细胞的重新分化,效应记忆型T细胞的比例在治疗前、治疗第24周及随访期无显著差异,这与既往报道不一致[14]。PD1、2B4、CD160、KLRG1等抑制性受体的高表达是造成CHC患者T细胞功能耗竭的因素之一。本研究发现,DAAs治疗对上述分子表达的影响有限。除CD4+T细胞PD1的表达在随访第12周时较治疗前显著降低外,其余均无明显变化,与Aregay等[11]报道一致。CXCR5+CD8+T细胞被证实在控制慢性病毒如HIV感染中发挥重要作用,其在慢性HCV感染中的作用以及与DAAs治疗的关系并不清楚。本研究发现CHC组患者治疗前外周血CD8+T细胞中CXCR5+CD8+T细胞比例较HC组有增高趋势,但差异无统计学意义。DAAs治疗第24周、随访第4周及第12周时则明显高于HC组,提示DAAs治疗可提高CXCR5+CD8+T细胞比例。
  
  
  CD3分子与T细胞受体(T cell receptor,TCR)组成TCR/CD3复合物,在TCR信号转导过程中起关键作用,与T细胞功能相关。CD3ζ的表达可影响T细胞的活化和增殖,其表达的下调和缺失与T细胞增殖减弱和产生细胞因子减少密切相关。本研究对CHC组患者总T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞CD3ζMFI进行分析,发现CHC组CD3ζ的表达显著低于HC组;DCV/ASV治疗并未增强CD3ζ的表达。这些结果与既往报道不一致[12,15],DAAs治疗并未改善T细胞的活化和增殖功能,可能与入组患者数较少、HCV基因型单一、随访期较短、检测方法不一致等有关。下一步我们将重点分析DAAs治愈的CHC患者HCV特异性T细胞增殖和产生细胞因子的能力,并探讨其潜在的调控机制。
  
  
  本研究发现DAAs在快速清除CHC患者体内病毒实现治愈的同时,患者外周血T细胞耗竭状态和功能无明显改善。虽然我们观察到CD8+T细胞中CXCR5+CD8+T细胞有上升趋势,但其在CHC中的作用有待进一步阐明。
  
  
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