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小白菊内酯对抑郁症大鼠炎症反应及氧化应激的调控作用

更新时间:2021-02-20 08:52点击:

  摘    要:
  
  
  为探究小白菊内酯(parthenolide,PTO)对抑郁症模型大鼠炎症反应和氧化应激的调控作用,采用探针捣毁嗅球与负压吸引联合法建立大鼠抑郁症模型,设健康组,OB模型组,OB+PTO低、中、高剂量组和OB+FLU组(阳性对照组),加药组给予腹腔注射PTO(125、250和500μg/kg)1周。ELISA检测炎症及氧化应激相关因子表达水平;免疫组化检测细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的表达水平;Western blotting检测组织炎症及氧化应激分子表达水平。结果显示:大鼠抑郁症模型复制成功;OB模型组大鼠血清中抑炎因子及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)较健康组显著下调,而促炎因子显著升高(P<0.01);OB+PTO中、高剂量组和OB+FLU组大鼠血清中抑炎因子及SOD较OB模型组升高,而促炎因子降低(P<0.05);AMP依赖的蛋白激酶α1(AMP-actived protein kinaseα1,AMPKα1)、过氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma co-activator-1 alpha,PGC-α1)和转运载体4(glucose transporter 4,GLUT4)的表达水平在OB+PTO中、高剂量组和OB+FLU组中得到有效恢复(P<0.05)。综上,PTO在500μg/kg剂量下对大鼠无明显毒性,并可以降低AMPKα1、PGC-α1和GLUT4的表达,抑制抑郁症大鼠体内炎症反应和氧化应激作用。
  
  
  关键词:
  
  
  小白菊内酯 炎性因子 氧化应激 抑郁症
  
  
  Regulation of parthenolide on inflammatory response and oxidative stress in depressive rats
  
  
  HAN Ya-qiong LI Tao GU Zheng CHEN Yong-xin
  
  
  The Second Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University;
  
  
  Abstract:
  
  
  To investigate the regulatory effect of parthenolide(PTO) on inflammatory response and oxidative stress in depression rats model, we established the depression model of rats by smashing olfactory bulb(OB) with probe and negative pressure aspiration. The healthy group, OB model group, OB+PTO low(125 μg/kg), medium(250 μg/kg) and high(500 μg/kg) dose groups and OB+FLU group(positive control group) were set up. PTO was intraperitoneally injected into animals of the drug-adding groups for one week. The expression levels of inflammatory and oxidative stress related factors were detected by ELISA, intercellular adhesion molecule1(ICAM-1) was detected by immunohistochemistry, and inflammation and oxidative stress molecules were measured by Western blotting. We found that the model of depression was successfully established. Compared with healthy group,the levels of anti-inflammatory and superoxide dismutase(SOD) in serum of OB model group were significantly lower, while the levels of inflammatory factors were significantly higher(P<0.01); the levels of anti-inflammatory and SOD in serum of the OB+PTO medium, high dose groups and the OB+FLU group were higher than those of the OB model group, while the levels of inflammatory factors were lower(P<0.05); the levels of AMP-actived protein kinase α1(AMPKα1), peroxisome proliferator-activated receptor gamma co-activator-1 alpha(PGC-α1) and glucose transporter 4(GLUT4) were effectively restored in the OB+PTO medium, high dose groups and the OB+FLU group(P<0.05). In conclusion, PTO has no obvious toxicity to rats at the dosage of 500 μg/kg, and can reduce the expression of AMPKα1, PGC-α1 and GLUT4, inhibit the levels of inflammatory response and oxidative stress in rats with depression.
  
  
  Keyword:
  
  
  parthenolide; inflammation; oxidation; depression;
  
  
  抑郁症是一种情感性精神障碍,患者常表现出情绪低落、轻生等症状[1]。有研究证实,氧化应激和炎症反应在抑郁症进程中起关键作用,受LPS和IL-1β刺激后,大鼠会产生抑郁样行为[2]。炎性因子经外周神经损伤诱导而过量表达时也会使动物产生抑郁样行为[3]。抑郁症患者丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平显著升高,药物治疗后降低[4]。有研究结果显示,小白菊内酯(parthenolide,PTO)是倍半萜内酯类天然产物,分离自艾菊、观光木等药用植物,分子式为C15H20O3,相对分子质量为248.32,被广泛应用于发热、抗炎和抗癌等[6-8]。本研究根据前人的科研成果,探究PTO在大鼠抑郁症模型中对炎症反应和氧化应激的治疗效果和作用机制,以期为抑郁症的治疗提供新思路。
  
  
  1 材料与方法
  
  
  1.1 材料
  
  
  细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、AMP依赖的蛋白激酶α1(AMP-actived protein kinase α1,AMPKα1)、过氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma co-activator-1 alpha,PGC-α1)、转运载体4(glucose transporter 4, GLUT4)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)一抗及脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)试剂盒,均购自美国abcam公司,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的山羊抗小鼠二抗购自美国Santa Cruz公司。ELISA试剂盒购自Elabscience公司,试剂如下:5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、5-羟基吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid,5-HIAA)、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-13、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、MDA、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、IL-1β、IL-6。
  
  
  1.2 仪器
  
  
  半干转膜仪、电泳仪以及PCR仪均购于美国伯乐公司;Multiskan GO酶标仪购自Thermo公司;Gel View 6000化学发光凝胶成像仪购于广州云星仪器有限公司。
  
  
  1.3 方法
  
  
  1.3.1 大鼠嗅球切除建立抑郁症模型
  
  
  60只3周龄SPF级SD大鼠,购自北京维通利华实验动物公司[许可证号为SYXK (京) 2014-0001,合格证号为0015675],饲养于标准笼具内,温度20~25 ℃,湿度40%~60%,光照12 h/12 h明暗交替,自由采食和饮水,适应性饲养7 d后进行后续实验。随机分为6组,设置健康组(cTRL组),OB模型组,OB+PTO低、中、高剂量组(OB+PTO 125、250、500 μg/kg)和阳性对照组[盐酸氟西汀(fluoxertine,FLU)](OB+FLU 10 mg)。大鼠适应性饲养1周后,在两耳连线中点位置将皮肤切开,使颅骨暴露,于距前卤前7~8 mm及与正中缝两侧2 mm处,使用电磨钻将颅骨钻出2个直径为2 mm左右的小孔,并使用探针慢慢搅动毁坏嗅球后,再用真空泵把破坏的嗅球组织抽出,将吸收性明胶海绵放入小孔止血。同时假手术组大鼠采用同样的方法,只是手术钻孔后不伤及嗅球。术后滴加青霉素溶液(2×105 U/mL)冲洗手术切口。缝合皮肤后,肌肉注射青霉素注射液4×104 U/只,持续给药3 d,防止术后感染。
  
  
  1.3.2 大鼠基本指标和行为学指标检测
  
  
  各组处理结束后,提取大鼠血清,检测血清中BDNF、5-HT和5-HIAA表达水平。糖水偏好试验:(1)训练,每天每笼放2个相同饮水瓶。(2)正式试验,第1个24 h,放2瓶等容的1%蔗糖水;第2个24 h,放等容的1%蔗糖水和纯净水各一瓶;禁食、禁水23 h后,放等容的1%蔗糖水和纯净水各一瓶,1 h后测量消耗量。计算公式为:糖水消耗量/(糖水消耗量+纯净水消耗量)×100%。
  
  
  1.3.3 ELISA检测炎性因子
  
  
  取大鼠血1 mL,低温离心机1 790×g离心8 min,取出上清液供试验使用。加样设置:分别设空白孔,标准品孔,待测样品孔。酶标包被的板子上加标准品50 μL,先加入样品稀释液40 μL于待测样品孔,然后加待测样品10 μL。孵育:封板后置于37 ℃环境孵育30 min。液体配置:将30倍洗涤母液经蒸馏水稀释30倍备用。洗涤:缓慢揭掉封板膜,将液体弃去,甩干,每孔加适量洗涤液,放置30 s后弃去,重复5次,拍干板子。加酶:每孔加酶标试剂50 μL,空白孔不加。孵育:再次封板后放37 ℃孵育30 min。洗涤:小心揭掉封板膜,甩干液体,每孔加适量洗涤液,放置30 s后弃去,重复5次,拍干板子。显色:各孔加入显色剂A液50 μL,再加显色剂B液 50 μL,缓慢震荡混匀后,37 ℃避光显色10 min。终止:各孔加入50 μL终止反应液,使反应终止(终止后蓝色立即转为黄色)。测定:用空白孔进行调零,依次测量每孔光密度[D(450 nm)]。测定应在加入终止液后的15 min内进行。
  
  
  1.3.4 免疫组织化学法分析组织中抗原表达
  
  
  取出组织后用PBS清洗8次,去掉坏死组织及血凝块。用4%多聚甲醛在4 ℃下固定24 h。PBS清洗3次,再用30%、50%和70%酒精依次清洗。脱水,石蜡包埋。1% Triton X-100处理15 min,3% H2O2处理15 min。5%羊血清封闭30 min后依次孵育一抗和二抗。染色封片。
  
  
  1.3.5 Western blotting检测组织中相关蛋白表达
  
  
  取100 mg各组脑组织,PBS清洗3次,用添加有终浓度为1 mmol/L的蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)的裂解液进行裂解,提取总蛋白。二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法检测总蛋白浓度,10% 的SDS-PAGE分离蛋白后,再用半干转膜仪将蛋白质转移至聚偏氟二乙烯(poiy vinylidene fluoride,PVDF)膜上。使用5%脱脂牛奶将蛋白室温封闭2 h,再加一抗(AMPKα1、PGC-1α、GLUT4和GAPDH;稀释度1∶400)在4 ℃冰箱内封闭过夜,次日加辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗(稀释度1∶2 000)在室温封闭1 h,滴加化学发光液(enhanced chemiluminescent,ECL)后曝光显影。SDS-PAGE分离并转至PVDF膜,经5% BSA封闭后依次孵育相应一抗和二抗。显色并统计灰度值,计算相对表达量。
  
  
  1.4 统计学处理
  
  
  采用SPSS 19.0软件进行统计分析,定量数据以x¯±s表示,方差齐且服从正态分布,则组间比较用One-Way ANOVA。以P<0.05为差异有统计学意义。
  
  
  2 结果
  
  
  2.1 OB诱导建立抑郁症大鼠模型
  
  
  OB诱导建立抑郁症大鼠模型后,采用ELISA检测大鼠血清中抑郁症标志物BDNF、5-HT和5-HIAA水平,结果显示,与健康组大鼠比较,OB模型组大鼠血清中BDNF、5-HT和5-HIAA的表达水平明显下降(P<0.05,图1A~图1C);糖水偏好试验结果显示,与健康组大鼠比较,OB模型组大鼠糖水偏好百分比显著降低(P<0.01,图1D)。这说明大鼠抑郁症模型建造成功。
  
  
  图1 OB诱导建立大鼠抑郁症模型
  
  
  2.2 PTO改善大鼠体内炎性因子水平
  
  
  ELISA检测血清中相关促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β和抑炎因子IL-4、IL-10、IL-13水平。结果显示,与健康组比较,OB模型组促炎因子显著上升,而抑炎因子则显著下降(P<0.01);与OB模型组比较,OB+PTO低剂量组差异无统计学意义(P>0.05),OB+PTO中、高剂量组和OB+FLU组大鼠促炎因子水平下调,而抑炎因子水平升高(P<0.05)。(图2)
  
  
  图2 ELISA检测各组大鼠血清中炎症及氧化应激相关因子水平
  
  
  2.3 PTO降低抑郁症大鼠脑组织中ICAM-1表达
  
  
  免疫组化检测大鼠脑组织中ICAM-1表达。结果显示,与健康组比较,OB模型组ICAM-1表达水平急剧升高(P<0.01,图3);而与OB模型组比较,OB+PTO低剂量组大鼠脑组织中ICAM-1表达水平差异无统计学意义(P>0.05),OB+PTO中、高剂量组和OB+FLU组大鼠脑组织中ICAM-1表达水平均下降(P<0.05,图3)。
  
  
  图3 免疫组化检测大鼠脑组织中ICAM-1表达水平
  
  
  2.4 PTO改善抑郁症大鼠血清中氧化应激相关分子水平
  
  
  ELISA检测血清中氧化应激相关因子SOD、MDA和LDH水平,结果显示,与健康组比较,OB模型组SOD表达水平明显降低,而MDA和LDH表达水平则显著上升(P<0.01);与OB模型组比较,OB+PTO低剂量组三者表达水平差异无统计学意义(P>0.05),OB+PTO中、高剂量组和OB+FLU组SOD水平上调,MDA和LDH水平下调(P<0.05)。(图4)
  
  
  图4 ELISA检测各组大鼠血清中氧化因子表达水平
  
  
  2.5 PTO改善大鼠体内代谢因子水平
  
  
  Western blotting检测组织中代谢相关因子AMPKα1、PGC-1α和GLUT4表达水平。结果显示,与健康组比较,OB模型组中三者表达水平明显降低(P<0.01);与OB模型组比较,OB+PTO低剂量组三者表达水平差异无统计学意义(P>0.05),OB+PTO中、高剂量组和OB+FLU组三者表达水平均上调(P<0.05)。(图5)
  
  
  图5 Western blotting检测各组大鼠氧化应激相关因子表达水平
  
  
  3 讨论
  
  
  抑郁症现已成为全球第四大疾病,由世界卫生组织最近公布的调查数据表明,全世界抑郁症患者已超过3.5亿人[6-7]。我国有研究人员通过文献综述总结发现,目前我国抑郁症患者终生患病率约为3.3%[8]。抑郁症患者不但给个人和家庭带来痛苦,还给社会带来巨大问题和负担[9]。
  
  
  深入研究抑郁症发病机制对治疗抑郁症具有重大意义。最新研究结果显示,抑郁症患者体内中枢神经系统、神经内分泌系统、免疫系统等均有不同程度的病理性改变,由此产生了氧化应激和炎症反应假说、单胺假说、免疫系统异常假说、神经递质受体假说、神经内分泌功能假说等[10]。其中炎症反应和氧化应激假说逐渐受到人们的重视,此假说主要观点:机体受到应激后,原有的氧化还原平衡被打破,相应的抗氧化酶功能异常,活性氧(reactive oxygen species,ROS)表达过量,导致机体释放大量促炎因子,产生严重的炎症反应,进一步引起神经细胞内重要生物大分子结构和功能紊乱,进而促进抑郁症的发生[11]。因此,本研究着重对OB大鼠模型通过PTO治疗前后的氧化应激和炎症反应进行对比检测,发现OB模型组大鼠氧化应激和炎症反应均明显上调,PTO治疗后均有所改善。
  
  
  现代医学在治疗抑郁症中存在起效慢、疗程长、副作用大等问题。中医药治疗抑郁症有疗效好、副作用少、易被患者接受等优点,因此受到普遍关注和越来越深入的研究。如贯叶金丝桃中的金丝桃素能通过促进大鼠脑内5-HT、去甲肾上腺素的表达治疗抑郁症[12];柴胡可以通过降低大鼠前额叶中多巴胺和5-HT含量来治疗难治性抑郁症[13]。现有大量研究证实,PTO具有抗炎、抗肿瘤及抗血小板聚集等特性。如PTO通过抑制TNF-α、IL-1及环氧化酶2(Cyclooxygenase-2,COX-2)等的表达而具有抗炎作用[5]。本研究发现,OB大鼠模型经过PTO治疗后,体内氧化应激和炎症水平得到了有效改善。
  
  
  已报道,PTO具有抗炎和抗氧化应激效用,本研究在OB诱导的大鼠抑郁症模型中证实,PTO可以有效降低大鼠血清中ICAM-1和TNF-α、IL-6、IL-1β等相关促炎因子水平,并且能够提高IL-4、IL-10和IL-13水平,说明PTO具有有效抵抗促炎因子的作用。文献报道,这些促炎因子可以激活细胞内NF-κB/ICAM-1途径,而ICAM-1可以在炎症部位促进细胞黏连[14]。经过免疫组化证实,当抑郁症模型大鼠经过PTO治疗后,脑组织中ICAM-1表达水平显著下调[15]。也有文献证明,IL-10可以通过信号传导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)磷酸化从而抑制IL-6、IL-1β和TNF-α的表达,抑制炎症反应[16]。同时,在抗氧化应激方面,IL-4可以有效增加SOD含量,减少MDA和LDH表达[4],说明细胞可以有效应对氧化应激(SOD升高),减少氧化应激水平(MDA降低),同时细胞活性增加(LDH降低)。
  
  
  有研究显示,亮氨酸可以激活AMPK及沉默信息调节因子1(silence information regulator 1,SIRT1)从而增加细胞抗氧化能力,减少脂质积累;同时可以减少NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β等表达水平,降低炎症反应[17]。另有学者证明,在人神经胶质瘤细胞中,帕罗西丁可以诱导AMPK的激活,增加葡萄糖摄取产生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP),提高线粒体的生物合成作用来实现抗氧化和抗炎症作用[18]。本研究证明,对OB诱导的大鼠抑郁症模型使用PTO治疗后,大鼠脑组织内AMPK1α、PGC-1α和GLUT4水平得到明显改善,提示PTO可能通过降低细胞内TNF-α、IL-6和IL-1β等炎性因子来改善细胞内环境,达到抗氧化和抑制炎症发生的目的。
  
  
  综上所述,PTO对抑郁症大鼠具有一定治疗效果,其发挥作用的机制可能是通过PTO激活AMPK及其下游PGC-1α和GLUT4通路来实现。通过AMPK通路可以有效降低大鼠体内炎性因子表达量;同时又可以增加抑炎因子表达并有效抑制大鼠体内氧化应激产物水平。这说明PTO在大鼠抑郁症模型中具有一定治疗效果,可为抑郁症临床治疗提供借鉴。但是PTO在体内发挥功能的信号通路比较复杂,需要进一步明确其相关信号转导机制并选择关键靶点分子才能为精准治疗抑郁症提供指导。
  
  
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