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生物钟的作用机制及其与衰老退行性变的关系

更新时间:2020-04-08 08:19点击:

    [摘要]在自然环境下, 生物体内的生物钟接受外界光暗和温度等周期信号,调整自身的时相,与外界
环境保持同步。生物钟控制着昼夜节律,使其具有内源性和自我维持运转的特点。通过裸藻野生型和突变株系
在生理生化等方面节律的变化,进-步分析起决定性作用的生物钟成分,从而深入剖析生物钟与昼夜节律之间
的机制,及生物钟与衰老退行性变关系,本文对此进行了综述。
 
    [关键词]生物钟昼夜节律细胞分裂周期纤细裸藻
几乎所有生物的许多生理活动和生化反应都表现出一种内源性的近似 1 小时的昼夜节律现象,昼夜节律是自然界最普遍的一种现象,可使生物体的生理、生化、行为等生命现象发生周而复始的节律性变化。这些昼夜节律现象受生物钟调节,内源性生物钟是产生昼夜节律的基础。裸藻是介于动物和植物之间的单细胞真核生物,有光条件下叶绿体产生类囊体,有光合功能产生,成为自养型代谢; 暗条件下叶绿体不能发育形成类囊体结构,只能进行异养型的代谢。本文综述了在裸藻野生型与突变株系中昼夜节律对细胞分裂节律的影响以及生物钟与昼夜节律振荡器之间的作用机制。
 
  1. 野生型和突变裸藻的细胞分裂节律性
 
  许多藻类、真菌和原生动物的细胞分裂周期显示出细胞分裂或"孵化"的持续昼夜节律[1].细胞分裂只发生在特定的昼夜循环相位---经常有恒定的黑暗或光照( 人工黑夜) ,相当于同步化昼夜循环中的黑暗间隔。这种"阀门效应器"现象反映一种昼夜振荡器( CO) 和细胞分裂周期( CDC) 之间的相互关系,在裸藻中已经被广泛研究[2].因为其将作为一种基本的机制分析,通过实现生物钟与细胞周期之间耦合,所以我们要深入探讨节律的种类。
 
  1. 1 野生型株系 昼夜生物钟的典型特性---通过白天而不是 1 小时光照和温度循环、持久性、起始反应性、可移动性、相位奇点和温度补偿来导引---发现可以用来描述在光合自养生长、绿色野生型株系中细胞分裂的节律[3 ~5].其中后两个特性更值得一提。
 
  1. 2 奇异点 数学研究已经预测,昼夜振荡器可能被描述为无节律的,显示为无相性、静止状态---在昼夜周期特定时间( 把这个"奇异点"叫 S*) 给予一定强度和持续时间的临界相[6,7].随着刺激强度的增加,过渡期从 1 型( 弱脉冲) 到 0型( 强脉冲) ,复位在特定阶段的点必需是不连续的,这个"断点"是相当于唯一的奇点。这种预测已经在一些昼夜系统的光和化学干扰中得到证明,潜在的细胞分裂节律的时钟也不例外。
 
  通过 3 小时光信号,裸藻相位漂移分裂节律的光照阈值已经被检测到[8].( 图 1A) 在给定的昼夜时间里,700 ~ 7500勒克斯强度的干扰可产生一样的相位漂移( Δ ) .然而,较低强度的信号可引起不同的反应。因此,在( 昼夜时间,CT)0. 4( 切点的近似值约在 CT23) 给予 40 ~ 400 勒克斯脉冲引起无节律性( 图 1B) ,群体恢复为不同步,呈指数增长。这种消失的脉冲强度和施加的 CT 是十分特异的: ( 图 1C) 在 CT21. 5给予 190 勒克斯的刺激仅产生与 7500 勒克斯信号大小相同的相位延迟( - Δ ) .作为一种接近临界脉冲的边界( 勒克斯和 CT) ,非同步性的不同程度是可以被观察到。大约在CT1( CT100) 处的 S*的位置相当于 0 型重置曲线最陡的部分[9],可能位于裸藻三维相位重置表面的轴线上。
 
  这个"临界脉冲"的存在和其相对应的 S*不仅更加支持裸藻这种昼夜振荡器调节细胞分裂周期的假设,也表明起搏器可能限制循环动力学。因为结果是由细胞群体获得,所以在单个细胞中我们不能推断振荡器的这种状态。细胞的无节律性也许就是单个细胞分裂周期位相分散的结果( 细胞不连贯) ,引起脉冲不同地相位漂移同步化的细胞。或者,临界脉冲也许已停止由群体组成的每一个昼夜节律时钟( 但不是继续进行的细胞分裂周期) .
 
  1. 3 光诱导定型与光周期的控制 裸藻和绿色裸藻更早的研究工作表明细胞分裂周期由两个连贯的过程组成[10 ~14]: 预定型阶段和定型阶段。在细胞分裂周期的 G1期,前者的过程将依赖光合作用生长。A 点表示 G1期细胞的长进程是依赖光的时间,而 T 点代表细胞甚至在晚上都能完成细胞分裂周期的时间。如果预定型阶段的细胞转移到连续黑暗,细胞分裂会被立即阻止在 A 点与 T 点间某处,而当定奇异点的定位在纤细裸藻光合自养生长的细胞,细胞分裂的昼夜振荡器潜在不同步的节律行为受一种"临界的"3 小时光信号所干扰。最初三个同相位、一起分裂的细胞都被利用,在一种 3 小时光照: 3 小时黑暗生活规则中,每一个细胞显示一个约 19 小时稳定的 τ。在昼夜时间( CT) 0. 4 里,3 小时的 700 勒克斯信号干扰细胞A 而细胞 B 仅被 3 小时的 190 勒克斯干扰( 在施加的昼夜循环里,每替换正常光间隔中的一个,就有 7500 勒克斯的强度,用阴影箭头代表) .而前者的信号引出一个相位漂移( ΔΦ) + 11. 2 小时( 以 1 为模式) 昼夜时间( 实时等于 14. 0 小时) ,与之相比较的,见到 7500 勒克斯光信号,尽管在群体中细胞分裂继续,但后者更弱的光脉冲( 曲线 B) 诱导无节律性。如果三分之一细胞( 曲线 C) 被一个与 190 勒克斯相同强度的 3 小时信号所干扰,在一个轻微不同的昼夜时间( CT21. 5) 里却被加强,尽管相位在某种程度上观察到 7500 勒克斯脉冲时被延迟( ΔΦ = - 8. 0 小时,CT 实时等于 -10. 0 小时) ,但细胞分裂节律继续。( 摘自 Malinowski JR,Laval-Martin DL,Edmunds Jr LN. J Comp Physiol B,1185,155: 257 - 267.
 
   Springer - Verlag. )图 1 相位漂移节律型阶段的细胞转移到连续黑暗,细胞分裂周期的剩余时间继续进行,直到接下来的周期停止在 A 点[10].裸藻细胞分裂周期进程中的光合作作用规则就类似于异养型生物的营养控制。酿酒酵母或粟酒裂解酵母的营养匮乏,使细胞分裂周期停留在 G1期或者 G2期[15 ~17],而前进已经超出了"开始"( 在G1/ S 边界) 或者控制大小检测点的酵母细胞致力于完成细胞分裂周期,即使它们正在经受饥饿[18].
 
  一项裸藻在对数线期能进行光合自养生长的细胞分裂周期进程中昼夜效应的研究,Hagiwara 等[19]证明黑暗诱导细胞分裂周期停滞和光诱导定型向细胞周期转变。不仅在 G1期,也在后 G1期发现光依赖的限制点。因此,如果营养从连续光照转移到连续黑暗,在 G1,S 或者 G2期的一些( 定型的) 细胞甚至在连续黑暗时就能经历一个或两个细胞分裂周期过渡,最终停滞在 S 期、G2期或有丝分裂 G1后期。其他( 未定型的) 细胞在细胞分裂周期是不能继续前进的。接受更高强度光照的定型细胞,更可能在连续黑暗时经历细胞周期转变,以及在每个细胞分裂周期中更早地定型。在细胞分裂周期的G1,S 或 G2期的固定相点不能完成定型。
 
  因此,裸藻细胞分裂周期转变的定型,由光强度组成细胞周期相位的成熟度控制。另外,Hagiwara 等[20]已经证明,昼夜振荡器可以调节这些细胞分裂周期相位转变定型的光响应。当裸藻细胞被 14 小时光照: 10 小时黑暗调节,然后被转移到连续黑暗时,在最后昼夜光周期的第 8 个小时,细胞就停滞在 G1、S 或 G2 期。随后这些在不同昼夜时间暴露 6 小时光脉冲的暗停滞细胞,在细胞分裂周期以依赖脉冲的昼夜时间方式允许它们进一步推进( 图 2) .光诱导的最大值发生在微暗的环境( 昼夜时间 CT12) .这些结果证明有一种细胞周期转变定型的光诱导的昼夜阀门效应器,不只是细胞分裂,也更早涉及这些部分---细胞繁殖的光周期调节。应用除草剂敌草隆( DCMU) 、DBMIB、甲基紫精( TMPD) 和 CCCP 作抑制试验的结果显示: 细胞分裂 G2期细胞的光诱导定型,在非周期性光合作用的电子传递中,需要源自上游信号的光,特别是细胞色素 b6-f,但不需要进程中所要求的能量代谢[20].
 
  1. 4 突变株系 为了消除生物钟可能存在的细胞间区和排除之前常引起节律性及提供生长能量的可能信号影响,我们已经选了无叶绿素的裸藻 ZC 突变株---一种必需的有机异养型生物---一系列用来平行于那些在野生型株系中开展的研究[16].细胞分裂节律可能被 12 小时光照: 12 小时黑暗调节,或甚至由单脉冲架构的光周期调节( 1 小时光照: 23小时黑暗) ,节律跟随着连续黑暗自由振荡至少 8 天( τ =25. 5小时) ,提供总的增长速率或世代时间( g) > 1 小时( 图 5) .
 
  类似地,从其他裸藻光合作用的突变株中很少获得这样的结果,比如白色、热褪色、无叶绿素的 W6ZHL 株系和紫外光诱发P4ZUL 突变株[1,13,15].ZC 突变株光信号的 0 型相位反应期曲线是从 15 个相位漂移试验中生成[16]( 图 3) ; 这条相位反应曲线( 图 4) 类似于先前用野生型株系获得的结果[9].这些研究为细胞分裂周期控制中昼夜振荡器的作用,提供了更加确凿的证据,有效避免了施加昼夜循环双用途的问题: 作为生长的能源或者"基质"和作为潜在生物钟的时间暗示( 授时因子) .
 
  因此昼夜振荡器在裸藻的细胞分裂周期控制中起到很重要的作用,作为其他真核细胞的代表。有丝分裂不是一个振荡器重要的组成部分,但却位于其下游。细胞分裂的阻断不应让这个系统停止振荡[21,22].因此细胞分裂会是潜在生物钟的一只"手".我们已经用两种方法在野生型中检验了这个假说: ①如果不同步的分裂节律由于 Vit B12原始水平低下而停止,而如果这种抑制随后通过 B12重新向媒介释放,节律又能在未被干扰的控制中重新开始。②若给不同步的细胞以乳酸的脉冲,暂时加速细胞分裂周期和覆盖昼夜振荡器[13],当补充的基质被耗尽后,节律期最终恢复,节律期又处在平静控制的阶段。这些结果与之前发现的结果相符,因为通过向媒介加入含硫化合物,在连续光照里,P4ZUL 突变体不同步的节律性同步恢复[15].
 
  1. 5 无色裸藻突变株的呼吸活动 光合作用的昼夜节律在纤细裸藻野生型 Z 培养物中已被报道[23],其中媒介里的自由 O2浓度用克拉克电极连续测量。中午产氧达峰值,节律在连续光照里持续至少 8 个周期,从而更早证实发现的结果[24,26].这些数据被延伸到缺乏功能叶绿体的无色突变株[23],但就这个株系,节律相位在野生型菌株中却是相反的,在( 人工的) 黑夜,媒介中出现氧气浓度的最高值( 图 5) .突变株细胞的节律直接对更复杂的昼夜循环起反应,红光( >518nm) 和蓝光( <550nm) 在调节呼吸活动与给定的白光相比,如 8 小时光照: 8 小时黑暗( 同步化这些细胞) 同样有效。因此,能量的需求要么由光合作用,要么由呼吸作用提供,取决于细胞的类型,这都是受光和昼夜节律生物钟两者的控制。光合作用节律的起源,可能位于与这两个光合系统相关的光捕获蛋白( LHCPs) 的光诱导综合体内,这个综合体受生物钟控制,人工白天显示增加高达 20 倍( 见下面部分)[27].
 
  2. 昼夜节律振荡器与细胞周期生物钟之间的耦合
 
  我们已经回顾了裸藻细胞分裂周期的生物钟控制的证据( 与其他微生物一样) .这种"阀门效应器"现象反映的是昼夜振荡器和细胞分裂周期之间的相互关系。如果不是作为振荡器自身的一个要素,而是作为输入输出信号通路的连接环,这种耦合可受 cAMP 影响,在细胞分裂周期的调节和生物钟功能中已经涉及[18].
 真核细胞的细胞分裂周期是一个复杂的级联事件,以细胞复制为顶点[28].从一种调节状态到另一种开始的这些转变,是它们自身的反馈控制,决定细胞物理状态的底物修饰。由遗传和生化分析阐述的基本机制,已经在以下生物体中保守,如酵母菌、非洲爪蟾蜍、蛤蚌、海星受精卵、培养的人类细胞和高等植物[29].
 
  两个重要转变控制点存在细胞分裂周期 G1/ S 和 G2/ M边界。M 期被描述为激酶的激活( MPF,成熟促进因子,当注入爪蟾卵细胞时,以诱导细胞分裂的能力命名) ,其中包含两个组件子单元。一个是 p34cdc2蛋白( S. 非洲粟酒基因 cdc2 或同族体的产物,S. 啤酒的 CDC28) ,其能使体内的酪蛋白及组蛋白 H1 磷酸化和在有丝分裂有最大的激酶活性。另一个是细胞周期蛋白,其浓度在细胞分裂周期之间波动。它在细胞间期逐步地累积,形成 p34cdc2复合体和激活蛋白激酶; 在有丝分裂中降解,灭活激酶和 MPF 的活性。因此,细胞周期蛋白 -cdc2 / CDC28 ( MPF) 系统就像一个振荡器或者"生物钟",在有丝分裂时重设到细胞间期和其似乎组成一个通用的细胞分裂循环的"引擎"[29].现在我们知道细胞周期蛋白的整个家族,p34cdc2周期性地把调节细胞分裂周期进程的蛋白激酶活性联系起来造成连续波动,在植物和动物的细胞分裂周期中,cdc2 关联基因的确切种类得到不同表达。
 
  2. 1 环腺苷酸( cAMP) 的作用 众所周知,cAMP 在细胞的调节中起着关键作用[30],可影响昼夜振荡器和p34cdc2---细胞周期蛋白通路之间的耦合,( 可能和其他参与者一致) 参与细胞分裂周期活动的阀门效应器到昼夜周期的特定相位。
 
  甚至,cAMP 似乎有能力控制细胞分裂周期进程中某些限速步骤,刺激一些细胞的增值,但在其他细胞,却有相反的效果,或一点效果都没有[31,32].在很多细胞类型中,cAMP的短暂增加与 G1/ S 和 G2/ M 边界的细胞周期转变有关。酵母菌的遗传试验和哺乳动物的药学研究[30,33]已经显示,cAMP 水平的一过性升高和接着下降,对于 DNA 的合成和MPF 的诱导酪氨酸-脱磷酸作用激活的启动是有必要的[34],第二次 cAMP 剧增与完成相关,从有丝分裂中退出[35].细胞分裂周期不同相位中,cAMP 浓度的相似变化已在裸藻中出现[36].这些信号分别与 p34cdc2- p60 ( G1细胞周期蛋白) 蛋白激酶复合物和 p34cdc2- 细胞周期蛋白 B ( 有丝分裂细胞周期蛋白) 蛋白激酶复合物功能相一致。
 
  因此,在动物和酵母菌中,cAMP 浓度波动代表细胞分裂周期进程,信号转导的重要环节。在真核细胞里,AC 信号通路的转录调节下刺激受 cAMP-响应核因子家族调整。这些因子包含基本的结构域/亮氨酸拉链模序和 cAMP-反应元件( CRE) 二聚体。CRE-结合蛋白( CREB) 的功能由 cAMP 依赖性蛋白激酶的磷酸化作用调整。
 
  2. 2 环腺苷酸( cAMP) 对细胞分裂节律的干扰 如果周期性的信号在裸藻细胞分裂节律的产生中起作用,通过昼夜振荡器,干扰或覆盖 cAMP 水平的控制这一条件应该在下游活动中引起扰乱[18].用了这种药( 图 6A) ,依靠细胞分裂周期的相位,引起细胞分裂周期的缩短或加长,通过外源性cAMP,其振荡的干扰导致了来自昼夜定时器细胞分裂周期的暂时解耦合。当在 CT16 和 CT22 之间给予 cAMP 时,能观察到前进; 当在 CT03 和 CT09 之间给予 cAMP 时,能获得下一个同步分裂步骤( 相当于 9 小时) 的延迟。在 CT06-08 和 CT18-20 时获得最大效应,相当于内源性 cAMP 水平是最低的时间。在昼夜时间已经获得细胞分裂周期的最大 + ΔΦs 或者- ΔΦs,也可得到计量反应曲线。仅仅 1 nM cAMP 足以干扰细胞分裂周期运输。与细胞分裂周期的细胞周期蛋白生物钟相比,不像可兴奋组织,其 cAMP 的确能相位漂移信号输出节律[37,38],昼夜振荡器不用通过添加 cAMP 来重置: 分裂节律回到原始位相( 图 6B) .
 
  随着 cAMP 的注入,在生长曲线中观察到的细胞分裂步骤 ΔΦ ,反映细胞分裂周期进程速率的真实变化。通过流式细胞术测量细胞 DNA 含量提示[18],在 CT06 - 08 注入 cAMP延迟穿过 S 期,可能穿过 M 期( 图 7A) .若在 CT18 - 20 增加,cAMP 加速 G2/ M 过渡( 图 7B) .细胞分裂节律的这些效应只是短暂的: 48h 后,和未干扰的控制一样,分裂出现在相同的相位( 图 6B) .
 
  通过检测减小 cAMP 振荡振幅的药物效应,或者保持cAMP 在某一水平,这样所有 cAMP 的受体就能永久饱和,证明在细胞分裂周期进程中 cAMP 水平的内源性昼夜节律变化有足够的振幅产生类似的效应: 我们希望这种药用来阻止分裂节律性的表达。甚至 AC 的激活剂,cAMP 类似物毛喉素使cAMP 维持在异常的高水平[21],连续黑暗里,增加不同步 ZC突变株细胞,出现细胞群的快速失调和最终失去分裂节律性[18].
 
  这些发现指出,尽管裸藻中 cAMP 信号不重置昼夜振荡器( 因此 cAMP 不大可能代表生物钟的"齿轮") ,但它们的确调节细胞分裂周期进程,从振荡器作用下游---正如 Zatz[39]所提出的小鸡松果体细胞,可能存在并行通路。
 
  2. 3 下游通路: 环腺苷酸( cAMP) 依赖性蛋白激酶 在振荡的 cAMP 系统和细胞分裂周期之间,什么是连接环? 根据应用时 CT 的通路,无论什么是细胞周期受到影响的调节通路,它必须能解释相同信号是如何干扰不同的通路。一种可能性,是 cAMP 通过不同的"受体"表现为有选择性地调整两个调节通路中的一个或另一个。
 
  我们已经证明,裸藻 ZC 突变株包含 cAMP 依赖性蛋白激酶( cPKA 和 cPKB) 两个类型,对于 cAMP 和几个 cAMP 类似物来说,它们有不同的密切关系[40].发现细胞提取物包含两个 cAMP-结合蛋白,一个与 cAMP 有很高的亲和力( ( Kd 值为10nM 和 19nM) ,一个能通过 DEAE-纤维素色谱分析法分离。
 
  用肯普肽( 激酶底物肽) 作为底物( 从哺乳动物细胞中,由cAMP 依赖性激酶特异性磷酸化) 分析蛋白激酶。用 DEAE-纤维素色谱分析法部分提纯 cAMP 后可观察到激酶活性的刺激。分辨两个活性的峰值相当于两个不同的 cAMP 类似物特异性酶。因此,cAMP 依赖性激酶类似于动物细胞,通过靶蛋白的磷酸化,植物细胞中的 cAMP 信息传递可继续进行。
 
  在细胞分裂周期进程的控制中,通过 cAMP 类似物提供工具给它们各自作用的研究,抽出裸藻中识别的两个激酶的差异激活。我们断定,cAMP 或 cAMP 类似物的最小剂量可引起在人工白天或黑夜中分裂节律的 ΔΦs[18].在 CT06 -08和 CT18 -20 获得的不同结果提示,由两个不同的 cAMP 激酶来介导不同 CTs 时 cAMP 的效应。因此,选择性激活 cPKA的 8-苄氨基嘌呤-cAMP( 8-BZA-cAMP) 在 CT06 -08 增加时,诱导-ΔΦs,但在 CT18 - 20 时没有效应。相反地,特异激活cPKB 的 8-( 4-硫代氯苯基) -cAMP( 8-CPT-cAMP) 在 CT18 - 20增加时,诱导 + ΔΦs 和分裂节律性的减少,但在 CT06 -08 增加时,不干扰分裂节律。
 
  cAMP,8-BZA-cAMP,8-CPT cAMP 与 6-MBT-cAMP 的剂量之间也有关联,引起在 CT06 -08 时细胞分裂周期和 cPKA类似物 Ka值的干扰,结果提示 cPKA 在这些 CTs 时,介导cAMP 的延迟效应。同样地,相同核苷酸的剂量之间也有关联,引起在 CT18 - 20 时细胞分裂周期和 cPKB 类似物 Ka值的干扰,结果表明在 CT18 - 20 时 cPKB 介导 cAMP 的加速效应。这些发现简单的解释是这些激酶是在细胞分裂周期不同阶段表达,在哺乳动物细胞中,被描述为Ⅰ型和Ⅱ型 cAMP 依赖性激酶。
 
  3. 小结
 
  藻类比如纤细裸藻已经作为试验模型,被用来了解昼夜节律记时的作用机制,已经超过了半个世纪,是因为它们方便利用,易于测量其生理特征以反映昼夜节律的输出信号。另外,藻类的代谢轮廓分析日益重要,因为它们能提供丰富多样的化合物,对于食品、医药产业、生物燃料和公共卫生等方面具有很大潜在的经济价值[41].生物钟使裸藻能维持近似1 小时的昼夜节律,其主要通过接受光信号,经过一系列的信号转导途径,在昼夜振荡器中不断地产生振荡,最后通过输出途径控制基因的节律性表达等; 但仍存在局限性: 高通量组学筛查经常遇到的问题是只能鉴别基因和蛋白,而不能知道其功能。
 
  很多的功能分析会降低相关信息量,比如在昼夜时间的系列研究中,由于不完善的注释而很少使用。通过对裸藻昼夜节律深入的研究,对揭示生物钟的本质、生物进化的分子机制等具有重要意义,可为各种动植物包括人类的生产实践与医疗保健等方面提供可靠的理论依据。
 

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