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胆汁酸稳态调节的选择性剪接研究

更新时间:2020-05-08 08:23点击:

 一、胆汁酸的合成与转运
 
  胆汁酸是胆固醇代谢的主要产物,胆汁的主要成分,调节多个生物过程,包括刺激肝脏胆汁分泌和促进小肠吸收脂肪及脂溶性维生素。胆汁酸也可通过激活特异性的受体和信号通路调节甘油三酯、胆固醇和葡萄糖的稳态平衡。
 
  肝脏是合成胆汁酸的唯一器官。90% ~95% 的胆汁酸直接由肝细胞内的胆固醇代谢产生。合成途径包 括 胆 固 醇 7α-羟 化 酶 ( cholesterol 7 alpha-hydroxylase,CYP7A1) 介导的经典途径和类固醇 27羟化酶( sterol 27-hydroxylase,CYP27A1) 介导的替代途径两种。
 
  肠道内的胆汁酸仅 5% 由粪便排出,95% 在回肠末端被重吸收入血进行肠-肝循环。其中结合胆汁酸的重吸收与转运过程由两个转运蛋白超家族协同完成( 图 1,表 1) : 溶质载体( solute carrier,SLC)超家族介导入细胞过程,不消耗 ATP; ATP 结合盒( ATP-bingding cassette,ABC) 转运体超家族介导出细胞过程,消耗 ATP[1].牛磺酸/甘氨酸结合胆汁酸( taurine and glycin conjugated bile acids,T/G-BA) ,在回肠的重吸收主要由顶侧膜的顶膜钠依赖性胆汁酸转运体( apical sodium dependent bile acidtransporter,ASBT) ( SLC10A2) 和基底膜的有机溶质转运体( organic solute transporter alpha-beta,OSTα-OSTβ) ( SLC51A-SLC51B) 协同完成[2].而细胞内运输由回肠脂质结合蛋白( ileal lipid binding pro-tein,ILBP) 与胆汁酸结合。胆汁酸随门静脉血流运回肝脏,经肝细胞窦状隙膜的钠-牛磺胆酸共转运多肽( Na-taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)( SLC10A1) 进入肝细胞,再与新合成的结合胆汁酸一起由肝细胞胆小管膜的胆盐输出泵( bile salt ex-port pump,BSEP) ( ABCB11) 分泌入胆道系统。
 
  除了占大多数的 T/G-BA,少量硫酸盐或葡萄糖醛酸结合胆汁酸( sulfate and glucuronide conjuga-ted bile acid,S / U-BA) 由肠上皮细胞基底膜的多药耐药相关蛋白-3 ( multidrug resistance-associated pro-tein-3,MRP3) ( ABCC3 ) 泵入门静脉系统,再由肝细胞胆小管膜的 MRP2 ( ABCC2) 分泌入胆道系统( 图 1,表 1) .肠上皮细胞顶侧膜的 MRP2 将结合胆汁酸运回肠腔。少量羟基化胆汁酸 ( hydroxylatedbile acid,H-BA) 由肝细胞胆小管膜的多药耐药蛋白-1 ( multidrug resistance protein 1, MDR1 )( ABCB1) 分泌入胆道系统。游离胆汁酸在小肠各部和大肠通过弥散作用被动重吸收,由肝细胞窦状隙膜的有机阴离子转运蛋白 1B1 ( organic aniontransport protein 1B1, OATP1B1 ) ( SLCO1B1 ) 和OATP1B3 ( SLCO1B3) 摄入肝细胞[2].
部分胆汁酸不经肝脏过滤进入体循环,但在肾脏经肾小球滤过后被近球小管的 ASBT 和 OSTα-OSTβ 重吸收回体循环,尿液排出的胆汁酸量极少。胆汁淤积时肝细胞窦状隙膜的 OSTα-OSTβ、MRP3和 MRP4 ( ABCC4) 将各类结合及游离胆汁酸排入体循环,经尿液排出,具有一定的代偿意义。
 
  二、胆汁酸稳态的调节
 
  核受体( nuclear receptor,NR) 超家族成员法尼酯衍 生 物 X 受 体 ( farnesoid X receptor,FXR)( NR1H4) 作为转录因子,广泛参与胆汁酸稳态各环节的调节( 表 1) .FXR 通常与视黄醛衍生物 X 受体 α ( retinoid X receptor alpha,RXRα) ( NR2B1)形成异二聚体 FXR/RXRα,被激活后与靶基因启动子区 FXR 反应元件( FXR response element,FXRE)结合,直接上调 OSTα、OSTβ、ILBP、BSEP、OATP1B1和 OATP1B3 等 基 因 的 转 录[3,4]. 而 FXR 对CYP7A1、ASBT 和 NTCP 等基因的转录具有抑制作用,主要由以下两条通路介导[3,5]: ( 1) FXR-SHP-LRH-1 通 路,其中小异二聚体伴侣 ( small het-erodimer partner,SHP) ( NR0B2) 是 FXR 的直接靶基因,被诱导上调后,作为转录抑制因子与肝受体同系物-1 ( liver receptor homolog-1,LRH-1) ( NR5A2)结合,抑 制 LRH-1 的 转 录 激 活 作 用; ( 2) FXR-FGF15 /19 通路,成纤维细胞生长因子 15 /19 ( fibro-blast growth factor 15,FGF15〈小鼠〉,FGF19〈人〉)被 FXR 诱导上调后分泌入门静脉,随血流与肝细胞表面的 FGF 受体4 ( FGF receptor 4,FGFR4) 结合,激活下游信号通路抑制靶基因转录。CYP7A1 受FXR-SHP-LRH-1 和 FXR-FGF15 /19 两条通路的负反馈抑制作用[3].而 SHP、OSTα 和 OSTβ( Franken-berg 等。 2006) 均受到 FXR 激活和抑制作用的动态调节[5,6].CYP7A1 的转录也受肝 X 受体 α ( liver X re-ceptor alpha,LXRα) ( NR1H3) 的直接上调[5].胆固醇代谢合成胆汁酸的中间产物---氧化甾醇可激活 LXRα,对 CYP7A1 进行前馈调节; 而胆汁酸可激活 FXR,对 CYP7A1 进行负反馈调节[5].有趣的是LXRα / RXRα 与 FXR / RXRα 均可直接上调 OSTα、OSTβ、ILBP 及 OATP1B1 的表达[4,5,7].
 
  三、选择性剪接的调节与功能
 
  真核生物的结构基因中含有具有表达活性的外显子,还含有无表达活性的内含子。转录时,外显子及内含子均转录到 mRNA 前体 ( pre-mRNA) ,再通过剪接作用剪切掉内含子,连接外显子,得到成熟mRNA.而同一个 pre-mRNA 可通过不同的剪接方式产生不同的 mRNA,称为选择性剪接( 或可变剪接) .哺乳动物体内编码蛋白质的基因数目与线虫和拟南芥近似,与生物体和细胞的复杂性严重不符。
 
  而选择性剪接是增加真核生物多样性的重要机制之一。有 研 究 认 为94 % 的 人 类 基 因 具 有 选 择 性剪接[8].剪接过程由剪接体( spliceosome) 催化,它是由五个含有小核 RNA ( small nuclear RNA,snRNA) 的小核核糖核蛋白( small nuclear Ribonucleoprotein,snRNP) 及其他非 snRNP 蛋白质组成的大分子核酸蛋白复合物。剪接体识别内含子中的 5‘剪接位点、3' 剪接位点及分支位点,完成内含子的切除和外显子的连接。剪接位点的识别受到多个顺式调控元件与反式调控因子的控制,顺式调控元件包括外显子剪接增强子( exon splicing enhancer,ESE) 、外显子剪接沉默子( exon splicing silencer,ESS) 、内含子剪接增强子( intron splicing enhancer,ISE) 和内含子剪接沉默子( intron splicing silencer,ISS) .剪接调控因子主要包括富含丝氨酸( serine,S) 和精氨酸 ( ar-ginine,R) 结构域的 SR 蛋白 ( SR protein) 和核不均一核糖核蛋白( heterogeneous nuclear Ribonucleo-protein,hnRNP) .SR 蛋白主要与剪接增强子结合,提高相邻剪接位点的活性。hnRNP 主要与剪接沉默子结合,抑制相邻剪接位点的活性。
 
  兴奋性与抑制性剪接调控因子的相对浓度、磷酸化状态、pre-mRNA 的二级结构均会影响剪接位点的选择。而 microRNA ( miRNA) 通过对剪接调控因子 mRNA 降解或翻译抑制,间接影响选择性剪接。由于 RNA 转录与剪接在空间和时间上紧密偶联,转录延伸的速率( 即 RNA 聚合酶 II 的移动速率) 不同可影响强、弱剪接位点的识别,延伸的速率减慢促进弱剪接位点的识别,导致选择性外显子的纳入。染色质构型、核小体定位、组蛋白修饰和DNA 甲基化可通过影响蛋白招募,或改变 RNA 聚合酶 II 的移动速率影响选择性剪接[18].
 
  由选择性剪接产生的转录变异体通常具有组织分布或发育阶段特异性。转录变异体的结构变化通常分为三类: ( 1) 选择性剪接使 mRNA 产生提前终止密码子( premature termination codon,PTC) ,引起无 意 义 介 导 的 降 解 ( nonsense-mediated decay,NMD) ,为真核生物控制 mRNA 质量的重要措施;( 2) 5’或 3' 非翻译区的改变,影响 mRNA 的稳定性或翻译,甚至第一外显子的改变伴有启动子改变,产生不同的转录调节模式; ( 3) 蛋白结构改变,影响蛋白的亚细胞定位与功能[19].选择性剪接改变蛋白结构具体包括: 1) 通过改变定位信号、翻译后修饰序列或与其他蛋白的相互作用位点而改变蛋白的亚细胞定位。亚细胞定位的改变也常伴有功能改变,尤其是膜结合型受体,其分泌型剪接变异体分泌入血会显着抑制正常的信号传导。2) 改变细胞的生命进程,选择性外显子的纳入或跳过,引起剪接变异体促凋亡/抗凋亡、增殖/抗增殖特性转换,影响血管新生,与肿瘤发育密切相关。3) 对转录因子的影响,选择性剪接改变反式激活结构域可影响 RNA 聚合酶 II 的活化,删除 DNA 结合域则导致与靶基因启动子结合能力丧失,转录因子可能无活性,也可能取代正常转录因子而产生显性失活作用。4) 影响酶的底物特异性或活性,通常使酶活性降低或丧失,但某些激酶的自身抑制作用被选择性剪接改变,也会产生组成性活化的激酶。5) 影响离子通道的开放时间、开放电压、离子特异性及对配体的反应性等各个方面[19].
 
  四、胆汁酸稳态调节的选择性剪接
 
  ( 一) FXR 核受体 FXR ( NR1H4) 有四种剪接变异体 FXRα1、FXRα2、FXRβ1 和 FXRβ2.FXRα和 FXRβ 具有不同的氨基端,而 FXRα1 和 FXRβ1在临近 DNA 结合域的铰链区多 4 个氨基酸残基( a-mino acid residue,aa) 的插入片断,导致其与靶基因启动子 FXRE 结合的亲和力降低。四种剪接变异体的组织表达分布不同,除了全部在肝脏高表达,FXRβ1 与和 FXRβ2 在回肠高表达,在肾脏中度表达,在胃、十二指肠和空肠低表达( β1 与 β2 各占50% ) ; 而 FXRα1 与 FXRα2 在回肠和肾上腺中度表达( α1 与 α2 各占 50%) .四种变异体对靶基因的转录激活能力也存在差异,其激活 SHP 和 BSEP 的能力相当,而激活 ILBP 的能力 FXRβ2 > FXRα2 》 FXRα1 = FXRβ1,最大差异超过 20 倍[9].在FXR 全身敲除小鼠的肝脏特异性过表达 FXRα2 或FXRβ2,均可极大程度纠正 FXR 敲除所致的肝脏基因表达谱改变,但在降低已升高的 HDL 水平、转录抑制类固醇 12α 羟化酶 ( sterol 12α-hydroxylase,CYP8B1) 的肝表达、增加胆汁池亲水性、促进中性甾醇经小肠排入粪便等方面,FXRα2 的作用强于FXRβ2.
 
  ( 二) FGFR4 成纤维细胞生长因子受体 FG-FR4 被 FGF15 /19 激活后介导 FXR 的负调节通路。FGFR4 基因包含 18 个外显子,蛋白为一次跨膜的受体型酪氨酸蛋白激酶,有 3 个细胞外免疫球蛋白( immunoglobulin,Ig) 样结构域。其中外显子 1 不翻译,外显子 2 编码信号肽,外显子 3 编码第 1 个 Ig样结构域,外显子 4 编码酸盒( acid box) ,外显子 5和 6 编码第 2 个 Ig 样结构域,外显子 7 和 8 编码第3 个 Ig 样结构域,外显子 9 编码跨膜区,外显子 10-12; 14-17 编码激酶结构域。在人乳癌细胞系发现一种可溶性 FGFR4 ( soluble FGFR4,sFGFR4) ,由于内含子 4 的保留,产生提前终止密码子,sFGFR4 分泌到细胞外,可抑制 FGF-1 介导的信号传导。而在人的胃肠道上皮细胞发现另一种可溶性 svFGFR4,编码跨膜区的外显子 9 被内含子 9 取代,蛋白分泌到细胞外。在小鼠发现两种 FGFR4 剪接变异体FGFR4-17a 和 FGFR4-17b,分别纳入内含子 17 的部分和全长序列,推测蛋白质缺少羧基端细胞内尾。小鼠生肌细胞中的 FGFR4( -16) 缺少外显子 16,缺失激酶结构域。而人垂体瘤来源的 FGFR4 ( pituita-ry tumor-derived FGFR4,ptd-FGFR4) mRNA 序列从外显子 5 开始,编码蛋白缺乏氨基端的信号肽和前两个 Ig 样结构域,蛋白定位于细胞浆,并且组成性磷酸化[10].
 
  ( 三) RXRα 核受体 RXRα ( NR2B1) 在小鼠睾丸发现 2 个剪接变异体 mRXRα2 和 mRXRα3,分别用了不同的选择性外显子 1b 和 1c,而外显子 2及之后的序列与原有主要亚型 mRXRα1 相同。mRXRα2 和 mRXRα3 编码相同的蛋白,与 mRXRα1相比缺少氨基端的 28aa,转录激活功能域 1 ( activa-tion function-1, AF-1 ) 受 影 响。 mRXRα2 和mRXRα3 仅表达于睾丸,在青春期高表达,可能在生精过程起作用。随后在人也发现 2 个剪接变异体hRXRα2 和 hRXRα3,hRXRα2 与 原 有 主 要 亚 型hRXRα1 共用外显子 2 及之后的序列,编码蛋白缺少氨基端的 27aa,hRXRα3 与 hRXRα1 共用外显子3 及之后的序列,编码蛋白缺少氨基端的 97aa.hRXRα3 表达于脑、脾和前列腺,而 hRXRα2 表达水平过低检测不到。hRXRα2 和 hRXRα3 具 有 与hRXRα1 类似的转录活性和对配体的剂量反应曲线,但加入共激活因子后剂量反应曲线出现差异[11].
 
  ( 四) LXRα 核受体 LXRα ( NR1H3) 已在人发现 4 个剪接变异体 hLXRα2、hLXRα3、hLXRα4、hLXRα5.hLXRα2 应用选择性外显子 1,伴有启动子改变,氨基端缺少 45aa,使转录活性减低,仅在睾丸高表达。hLXRα3 的外显子 6 被跳过,导致配体结合区缺少 50aa,不能与配体结合,无转录活性。虽 然 hLXRα3 可 竞 争 性 抑 制 原 有 主 要 亚 型hLXRα1,但不具有显性失活作用,且 hLXRα3 在各组织低表达。hLXRα4 因保留了内含子 6 的 192bp,配体结合区有 64aa 的插入片断,具有微弱的转录活性。LXRα3 和 LXRα4 在小鼠组织也有低水平表达。hLXRα5 在外显子 7 和外显子 8 之间纳入了一个选择性外显子,含有终止密码子,导致羧基端序列缺失 91aa.hLXRα5 可与辅阻遏物相互作用,过表达时抑制 hLXRα1 的转录活性[12].
 
  ( 五) ASBT 顶膜钠依赖性胆汁酸转运体 ASBT.( SLC10A2) 为七次跨膜蛋白,由 384 个 aa 构成,氨基端位于细胞外,羧基端位于细胞内。已发现一个选择性剪接变异体 t-ASBT,由于外显子 2 的跳过引起移码,产生 154aa 的短亚型,仅保留氨基端的三个跨膜区。选择性剪接引起转运体的亚细胞定位和功能改变: ASBT 位于肠上皮细胞、胆管细胞和肾脏近球小管上皮细胞的顶侧膜,将管腔中的胆汁酸转运到细胞内; 而 t-ASBT 位于上皮细胞的基底膜,将细胞内的胆汁酸转运排出细胞。在胆管细胞 ASBT 与t-ASBT 均被负反馈调节,而在肠上皮细胞二者均被正反馈调节[13].可见 ASBT 与 t-ASBT 位于细胞两侧,协同调节胆汁酸的转运。
 
  ( 六) NTCP 钠-牛磺胆酸共转运多肽 NTCP.( SLC10A1) 为七次跨膜蛋白,由 362 个 aa 构成,氨基端位于细胞外,羧基端位于细胞内。NTCP 位于肝细胞窦状隙膜,将门静脉血流中的胆汁酸转运到肝细胞内。已发现一个选择性剪接变异体 NTCP2,最后一个内含子的保留使终止密码子提前出现,蛋白的羧基端变短,共含 317aa.全长 NTCP 为低亲和力/高容量转运体,而短的剪接变异体 NTCP2 为高亲和力/低容量转运体[14].
 
  ( 七) OATP1B3 位于肝细胞窦状隙膜的有机。阴离子转运蛋白 OATP1B3 ( SLCO1B3) 摄取游离胆汁酸,仅表达于肝脏。而在结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和肺癌等癌组织发现了一种 OATP1B3 剪接变异体的广泛表达,称为癌特异性 OATP1B3( cancer-specific OATP1B3, csOATP1B3 ) .csOATP1B3 的转录起始于选择性外显子 2a,缺少外显子 1 和 2,导 致 氨 基 酸 序 列 在 氨 基 端 缺 少28aa[15].csOATP1B3 的亚细胞定位也显着改变,主要位于细胞浆,仅有少量转位到细胞膜。转录起始位点的改变伴有启动子改变,产生不同的转录调节模式[16].
 
  ( 八) MRP4 多 药 耐 药 相 关 蛋 白 MRP4( ABCC4) 定位于肝细胞窦状隙膜,将肝细胞内的胆汁酸泵入体循环; 在肾脏定位于近球小管上皮细胞顶侧膜,将肾小管上皮细胞内的胆汁酸泵入管腔,促进胆汁酸由尿液排出。研究发现在人、猴和啮齿动物存在高度保守的 MRP4 选择性外显子 1a 和 1b,可组合形成 3 种选择性剪接变异体 V1、V2 和 V3,但均会形成提前终止密码子,引起无意义介导的降解[17].
 
  五、结语与展望
 
  选择性剪接是增加真核生物多样性的重要机制,影响着 mRNA 的转录调节与稳定性、蛋白质的细胞定位与功能。参与胆汁酸转运的多种转运体和调节胆汁酸稳态平衡的多种转录因子存在选择性剪接。选择性剪接已逐渐成为研究热点之一。探讨剪接变异体的功能、内外环境刺激选择性剪接发生的机制与网络调节,对于深入研究机体生理功能及疾病的发生发展规律具有重要意义。
 
  参 考 文 献
 
  1 Klaassen CD,Aleksunes LM. Xenobiotic,bile acid,andcholesterol transporters: function and regulation. PharmacolRev,2010,621 ~ 96.
 
  2 Dawson PA. Role of the intestinal bile acid transporters inbile acid and drug disposition. Handb Exp Pharmacol,2011,201169 ~ 203.
 
  3 Matsubara T,Li F,Gonzalez FJ. FXR signaling in the en-terohepatic system. Mol Cell Endocrinol,2013,36817 ~29.
 
  4 Meyer Zu Schwabedissen HE,Bottcher K,Chaudhry A,etal. Liver X receptor alpha and farnesoid X receptor are majortranscriptional regulators of OATP1B1. Hepatology,2010,521797 ~ 1807.
 

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