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外泌体源性蛋白对缺血性脑卒中的作用

更新时间:2020-11-18 08:21点击:

摘    要:
 
缺血性脑卒中严重危害人类健康和生活质量,探寻其发病机制和保护策略一直是脑血管研究领域的重点问题。外泌体作为细胞主动分泌的纳米级囊泡,通过携带丰富的蛋白质、DNA、miRNA等生物大分子,在胞间的物质运输和信息交换中发挥重要作用。研究表明,中枢外泌体在缺血性脑卒中的发病及后期的修复的病理生理过程中均发挥了重要的作用。外泌体源性蛋白作为外泌体的重要组成部分,参与了缺血性脑卒中的发生和发展。本文就外泌体源性蛋白质的生物学特性及其在缺血性脑卒中的作用和机制研究进行综述。
 
关键词:
 
外泌体; 缺血性脑卒中; 热休克蛋白; 炎症;
 
依据中国脑卒中(ischemic stroke)防治显示,我国每年发生脑卒中超过500万例,致残率高达80%,严重危害人类的健康。大量研究证明,缺血性脑卒中的发病机制可能与多种因素有关,其中包括大脑中动脉栓塞、高血压病、动脉粥样硬化、脑出血、神经细胞凋亡、炎症反应等因素。近年来,外泌体(exosome)作为具有完整膜结构的生物囊泡,在体内器官间、细胞间的信息传递中起着重要的作用,参与了体内许多生理和病理生理过程,成为医学领域的一大研究热点。蛋白质作为外泌体内容物中的重要组成之一,与缺血性脑卒中的发生和发展关系密切。本文就不同类别外泌体源性蛋白质在缺血性脑卒中的作用及其机制的最新进展进行综述。
 
一、外泌体的基本生物学特性
 
外泌体是细胞向胞外分泌的、直径为30~150nm的囊泡类物质。如图1A所示,外泌体的形成始于细胞质膜内陷成为内体。在内体转运复合体及一些相关蛋白的调控下,内体再次内陷形成由多个腔内小囊泡构成的多泡体(multivesicular bodies,MVB)。MVB最后与细胞膜融合并向外胞吐腔内小囊泡,即外泌体。体内多种细胞可分泌外泌体,如心肌细胞、免疫细胞、肿瘤细胞及间充质干细胞[1]。外泌体可存在于各种体液中,如血液、唾液、尿液、脑脊液、羊膜液和乳汁,也可存在于各种细胞培养液中(Dear等.2013)。如图1B所示,外泌体携带的生物信息分子包括蛋白质、micro RNA (mi RNA)、DNA、m RNA、si RNA、lnc RNA、脂质等。这些生物信息分子介导了外泌体胞间的信号转导。外泌体与受体细胞结合后,将这些信息分子传递给受体细胞,介导“细胞-细胞”的信号通讯和物质交换,从而参与受体细胞的生理和病理过程。
 
二、外泌体源性蛋白质概述
 
Exocarta数据库显示,外泌体所含蛋白质高达41860种。根据外泌体中蛋白质来源的不同,可将外泌体蛋白质分为两类:非特异性蛋白质和特异性蛋白质。非特异性蛋白质大部分是来源于亲代细胞保守区域的细胞质或细胞膜,主要包括细胞骨架蛋白、跨膜蛋白、膜联蛋白、代谢酶、核糖体蛋白、热休克蛋白、Rab蛋白以及黏附分子[2]。这些蛋白质主要参与外泌体的合成转运过程,并可用于鉴定外泌体。另一类是特异性蛋白质,即与细胞特殊功能有关的、表现出细胞特异性的蛋白质,例如抗原提呈细胞源性外泌体含有特异性的主要组织相容性复合体(Graner等.2007),神经元源性外泌体含有特异性的谷氨酸受体。每种细胞源性的外泌体中含有一至数种该细胞的特异性蛋白质,对所有细胞源性外泌体中的特异性蛋白质进行质谱分析,共检测到4600多种特异性蛋白质(王璐等.2018)。外泌体源性特异性蛋白质可能与细胞间信号转导功能相关,在抗原提呈、肿瘤、免疫、凝血等生理病理过程中发挥重要作用。外泌体通过内吞或者配体受体结合形式进入受体细胞,释放外泌体中的蛋白质、核酸等生物大分子,产生生物学效应[3]。蛋白质可通过物理、化学或者基因工程的方法导入外泌体。研究结果显示将Cre重组酶载入外泌体后,外泌体介导Cre重组酶跨血脑屏障转运,这为脑部疾病的靶向给药提供了思路[4]。
 
三、外泌体中热休克蛋白(heat shock proteins,HSP)与缺血性脑卒中的关系
 
HSP是一组能保护细胞免受应激影响的伴侣蛋白,它存在于所有真核细胞和原核细胞中。HSP是维持细胞正常生理功能及内环境稳态、提高应激状态下细胞生存率必需的[5]。越来越多的研究表明,一些特定的HSP如HSP10、HSP27、HSP60、HSP70、HSP90,可通过外泌体途径分泌至胞外[6],产生特定的生物学效应。
 
(一) HSP27、HSPB5与缺血性脑卒中的关系
 
由神经胶质细胞释放的外泌体对缺血性脑卒中后的神经系统具有保护作用[7],HSP27、HSPB5在其中起到重要的作用。HSP27、HSPB5是通过外泌体途径从细胞释放的[8]。外泌体运输HSP27及HSPB5至脑缺血部位的星形胶质细胞或神经元细胞,并可与靶神经元和星形胶质细胞表面特定丝氨酸残基结合,发生磷酸化[9]。HSP27与靶细胞表面的丝氨酸82位点结合,而HSPB5的磷酸化发生在神经元中丝氨酸19位点和丝氨酸59位点。HSP27被丝氨酸磷酸化后抑制ask1介导的细胞死亡信号传导,从而保护缺血损伤的神经元和星形胶质细胞[10]。HSP27主要参与了缺血性脑卒中后的早期反应。Piao等[11]发现,短暂性大脑中动脉闭塞1小时后,脑梗死区域大脑中动脉皮层HSP27含量显著增加。缺血性脑卒中中期患者血浆中的HSPB5含量显著高于晚期患者,提示外泌体源性的HSPB5可能在缺血性脑卒中中期起作用[12]。MAPKAPK-2是HSPB5的上游激酶,促进HSPB5的生成。MAPKAPK-2及其上游激酶p38b MAPK与HSPB5共同定位于半暗带神经元星形胶质细胞,HSPB5磷酸化,通过Toll样受体信号转导通路降低TNF-ɑ、IL-1ɑ、IL-1β和IL-6,调节缺血部位的炎症反应,并降低应激反应[13]。Arac[14]发现,相较于野生型大鼠,HSPB5基因敲除小鼠缺血性脑卒中后脑病变面积显著增大,进一步证实HSPB5对神经元细胞和星形胶质细胞具有显著的保护作用。
 
(二) HSP70与缺血性脑卒中的关系
 
正常大脑中HSP 70含量很低。大脑缺血损伤后,外周动脉血管内皮细胞分泌的外泌体含量上升,并运输HSP70至脑缺血部位,引起HSP70含量显著升高[15]。外泌体运送的HSP70通过多种机制起到神经保护的作用[16]。其一是抗细胞凋亡[17]。Hsp70能与凋亡蛋白酶活化因子1 (Apaf-1)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、细胞色素c等凋亡小体复合体或者胱门蛋白酶结合,抑制下游的凋亡级联反应,从而拮抗神经元细胞的凋亡,起到神经保护作用。其二是抗细胞坏死机制[18]。外泌体源性HSP70阻断性神经元坏死对脑损伤的治疗效果优于抗细胞凋亡。HSP70与神经元细胞溶酶体脂质双单酰甘油磷酸结合,具有稳定溶酶体膜的作用,保护细胞免受凋亡激活物和氧化休克的侵袭,从而抗神经元细胞坏死。其三为抗炎症作用。脑缺血后造成的脑损伤一定程度上与免疫反应有关。脑缺血2 4小时后,HSP7 0表达增加,并通过调节低氧诱导因子1α,调控转录NF-κB依赖方式,通过TLR2和TLR4受体通道途径减少炎症因子TNFɑ,起到抗炎症作用,保护神经细胞免受损伤,利于缺血后脑组织的修复。
 
四、外泌体源性淀粉样蛋白β与缺血性脑卒中的关系
 
神经元细胞、星形胶质细胞、N2a神经母细胞瘤细胞分泌的外泌体载有淀粉样蛋白-β(Aβ)[19]。脑缺血后,富含淀粉样蛋白-β的外泌体由外周血液和脑脊液释放入脑缺血部位的前额叶/扣带回后皮质。血液和脑脊液中淀粉样蛋白-β含量降低,大脑中含量升高(Southwick等.1996)。当淀粉样蛋白-β的产生和分解不平衡时,脑缺血部位出现淀粉样蛋白-β的积累。淀粉样蛋白-β积累于脑缺血部位将直接干扰神经细胞线粒体中的电子传递链,产生自由基,从而增加氧化应激[20]。同时,淀粉样蛋白-β作用于小胶质细胞和星形胶质细胞后,p-STAT3和pJNK信号通路增强,促炎细胞因子和趋化因子的表达增加,如白介素-1β,进一步增强了神经细胞的炎症反应[21]。淀粉样蛋白-β毒性强劲,对神经细胞具有毒作用,造成神经元细胞的坏死或凋亡(Querfurth等.2010)。这是引起缺血性脑卒中后认知障碍的原因之一,也是缺血性脑卒中严重程度的重要指标之一。而小胶质细胞能够内化神经元源性外泌体,进而吸收和降解脑缺血部位积聚的淀粉样蛋白-β,促进缺血性脑卒中后的大脑修复[22]。外泌体源性淀粉样蛋白加大脑缺血部位的神经损伤程度,小胶质细胞源性外泌体促进损伤后的大脑。
 
五、外泌体源性突触素(Synapsin)与缺血性脑卒中的关系
 
突触素是一种位于突触囊泡膜上,分子量为38k D的钙结合蛋白,主要由星形胶质细胞、小胶质细胞源性的外泌体携带运输。脑缺血后,脑缺血部位突触素含量显著上升。当超速离心去除缺血部位星形胶质细胞释放的外泌体后,脑缺血部位突触素含量至少减少70%[23]。说明星形胶质细胞释放的突触素主要由外泌体介导释放,而非直接由星形胶质细胞胞吐释放。星形胶质细胞源性外泌体介导的突触素,作用于因缺血受损的神经元细胞。突触素以寡糖甘露肽的形式与神经元细胞表面的神经细胞黏附分子(NCAM)区域结合,通过调节ERK1/2-Syn I通路使炎症因子IL-6和TNF-α减少,促进神经元生长、突触生长,保护缺血性脑卒中后的大脑,促进缺血大脑的修复。突触素能够保护神经元免受氧化应激的损伤,外泌体源性突触素作用于神经元细胞,促进脑缺血部位神经元的修复。
 
六、其他一些蛋白质的作用
 
外泌体中其他蛋白质也与缺血性脑卒中的发生发展及后期大脑神经功能的恢复有重要关系。大量研究表明,大脑神经系统的主要细胞即神经元细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞均能分泌外泌体。这些外泌体携带的蛋白质极易被神经元细胞吞噬,修复脑缺血引起的神经元损伤(Frohlich等.2013)。
 
外泌体传导的Notch信号在脑缺血后的血管发育和血管生成中起着重要作用[24]。Delta-like4蛋白(Dll4)是Notch的配体,主要介导血管生成过程中的Notch信号[25]。包裹Dll4蛋白的外泌体通过抑制Notch信号通路促进血管生成(Phng等.2009),促进缺血性脑卒中后神经的恢复。
 
狂犬病病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein,RVG)和溶酶体相关糖蛋白2b (exosomal protein lysosome-associated membrane glycoprotein2b,Lamp2b)能够相互融合并结合于外泌体表面。RVG和Lamp2b提高了外泌体的靶向运输效率[26]。这种结合了RVG和Lamp2b的外泌体特异性地靶向传递mi RNA-124至缺血后的脑梗死部位,大脑中巢蛋白阳性细胞显著减少,即外泌体mi R-124的递送促进神经祖细胞向神经发生方向发展,保护神经元[27]。
 
脂肪间充质干细胞源性外泌体中的色素上皮衍生因子(PEDF)具有抗炎、抗氧化和保护神经的特性。Huang等[28]发现当脂肪间充质干细胞源性外泌体中的PEDF含量增加时,外泌体的自噬和抑制神经元凋亡功能被激活,缺血性脑卒中的程度减轻,起到了对大脑的保护作用。
 
胎盘间充质基质细胞(PMSC)源性外泌体表面半乳糖凝集素-1(Galectin-1)高表达,半乳糖凝集素-1具有显著的神经保护作用,有助于缺血性损伤后大脑的恢复(Kumar等.2019)。
 
脑中血管内皮细胞源性外泌体分泌内皮细胞微粒(EMPs)的数量是判断缺血性脑卒中严重程度及脑损伤范围的有用指标(Chang等.2018)。
 
七、外泌体在脑部疾病靶向给药中的作用
 
血脑屏障(BBB)一直是缺血性脑卒中、帕金森综合征、阿尔兹海默症等脑部疾病给药的一大障碍,而外泌体能够透过血脑屏障将其携带的蛋白质、mi RNA、m RNA、si RNA等生物活性物质靶向作用于病变部位,起到相应的治疗效果。骨髓或脂肪组织源性的间充质干细胞通过外分泌作用促进缺血性脑卒中大脑的功能恢复和神经发生,从而产生治疗作用[29]。这种治疗作用的关键便是间充质干细胞源性外泌体的靶向运输、靶向给药机制。最新研究发现,通过细胞工程技术将具有治疗效用的c(RG-Dy K)等功能配体连接至外泌体表面,外泌体以其靶向给药功能高效能地治疗缺血性脑卒中等脑部疾病。外泌体中蛋白质的靶向给药机制亟待深入研究。而目前外泌体脑部疾病靶向给药临床应用较多、机制研究较为透彻的为外泌体中mi RNA、si RNA的靶向给药。例如,脑动脉闭塞后,间充质干细胞源性的外泌体将其中的mi R-133b靶向运输至神经元细胞和星形胶质细胞,mi R-133b抑制Rho A的表达,进而促进神经突生长,促进大脑功能的恢复。(Xin等.2012)外泌体将外周的mi RNA靶向运输至受损或病变脑部,通过一定机制较高精度地作用于受损或病变部位,治疗效果显著。同时,外泌体也可靶向运输si RNA。Lydia Alvarez-Erviti等(2011)将外源性BACE1 si RNA加载至外泌体内,外泌体表面的膜蛋白Lamp2b与神经元特异性RVG肽特异性融合,实现靶向运输。外泌体分泌BACE1 si RNA,使BACE1基因沉默,m RNA降解,BACE1含量显著下降,对阿尔茨海默症起到治疗作用。
 
八、结语与展望
 
如图2所示,外泌体源性蛋白质与缺血性脑卒中发病机制及其后期大脑的修复保护密切相关。在缺血性脑卒中的治疗中,外泌体源性蛋白质具备良好的应用前景。外泌体源性热休克蛋白、突触素等蛋白质对缺血性脑卒中后大脑神经元的保护作用为研制缺血性脑卒中药物提供了思路。淀粉样蛋白β等外泌体源性蛋白质对缺血大脑的损伤为防治缺血性脑卒中提供新的方向。然而有关缺血性脑卒中领域的外泌体源性蛋白质研究仍存在较多未知性。一些蛋白质具有缺血性脑卒中的后期修复作用,但其修复作用是否通过外泌体介导还未有研究证明。如整合素ɑvβ3、α5β1以及α6β1、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)具有促进缺血性脑卒中后的血管再生、神经元保护的作用[30],但其作用是否通过外泌体介导还有待进一步研究。
 
缺血性脑卒中后,星形胶质细胞、小胶质细胞等源性外泌体分泌的热休克蛋白、突触素、淀粉样蛋白显著增加,这些蛋白质通过相应通路促使TNF-ɑ等细胞因子的分泌,作用于缺血性脑卒中大脑,产生保护或损伤作用。
 
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