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基于网络药理学和分子对接探析骨碎补治疗骨关节炎的潜在作用机制

更新时间:2021-06-01 09:14点击:

  摘    要:目的:基于网络药理学和分子对接的技术与方法,探讨骨碎补治疗骨关节炎疾病的活性成分和潜在作用机制。方法:利用中药系统药理学技术平台(TCMSP)数据库,筛选得出骨碎补的潜在活性成分和相关靶蛋白,采用Genecards、OMIM等数据库预测骨关节炎的作用靶点,运用uniprot数据库查询相对应的基因名称,采用Cytoscape及string软件构建骨碎补的化合物-骨关节炎-靶点网络和蛋白质相互作用(PPI)网络,并在R语言中利用Bioconductor数据包进行GO生物学功能富集分析和KEGG通路富集分析,得到骨碎补治疗骨关节炎的有效成分和作用靶点。以PPI网络中度值(Degree)最大的靶点作为受体,关键化合物活性成分作为配体,预测受体-配体复合物结构与相互结合的氨基酸残基。结果:从TCMSP数据库中筛选出骨碎补的关键活性成分13个,参与骨碎补主要化学成分-化学成分作用靶点和骨关节炎治疗靶点-骨关节炎的共同作用靶点共有92个,获得PPI网络核心基因8个,网络药理学结果提示骨碎补可以参与调控骨关节炎34条信号通路,其中包含IL-17信号通路、细胞凋亡、PI3K-Akt等信号通路。分子对接验证骨碎补活性成分与关键靶点能够形成最佳复合体。结论:骨碎补治疗骨关节炎是多成分-多靶点-多途径的复杂过程,与多种靶点、信号通路协同调控有关。
  
  关键词:骨碎补; 骨关节炎; 网络药理学; 分子对接; 作用机制;
  
  Exploring the potential mechanism of Drynaria Rhizoma in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and molecular docking
  
  Yang Yongju Wang Junfeng Fan Chunbo Guan Xuefeng
  
  Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine Liaoning University of Traditional Chinese Medicine
  
  Abstract:
  
  Objective: To explore the active ingredients and potential mechanism of Drynaria in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and molecular docking technology and methods. Methods: tcmsp database was used to screen the potential active components and related target proteins of Rhizoma Drynariae. Genecards, OMIM and other databases were used to predict the target of osteoarthritis. UniProt database was used to query the corresponding gene name. The compound osteoarthritis target network and egg of Rhizoma Drynariae were constructed by using Cytoscape and string software White matter interaction (PPI) network was used to analyze the biological function of go and KEGG pathway by Bioconductor data package in R language to obtain the effective components and targets of Drynaria Drynariae in treating osteoarthritis. The target with the largest degree of PPI network was used as the receptor, and the active components of key compounds were used as ligands to predict the structure of receptor ligand complex and the binding amino acid residues. Results: 13 key active components of Drynaria fortunei were screened from tcmsp database, 92 were involved in the main chemical components of Rhizoma Drynariae and the joint action targets of osteoarthritis treatment target osteoarthritis. Eight core genes of PPI network were obtained. The results of network pharmacology indicated that Rhizoma Drynariae could regulate 34 signaling pathways of osteoarthritis, including IL-17 signal Signal pathways such as PI3K Akt, apoptosis and so on. Molecular docking confirmed that the active components and key targets of Drynaria fortunei could form the best complex. Conclusion: Rhizoma Drynariae in the treatment of osteoarthritis is a complex process of multi-component, multi-target and multi-channel, which is related to the coordinated regulation of multiple targets and signal pathways.
  
  Keyword:
  
  Drynaria Rhizoma; osteoarthritis; network pharmacology; molecular docking; mechanism of action;
  
  骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是临床最常见的骨关节病之一,主要临床表现为早期的疼痛和关节僵硬,后期可出现关节功能障碍或关节畸形,严重的影响老年人的生活质量和活动能力[1]。现代医学认为OA是一种慢性炎症反应,这种慢性炎症变化会改变软骨下骨生物力学性能,引发异常的软骨下骨重塑,加剧关节软骨退化,从而导致OA的发生发展[2]。
  
  骨碎补为水龙骨科植物槲蕨的根茎,其始载于《本草拾遗》,气味苦,性温。归属于肝、肾经,具有补肾强骨,疗伤止痛的功效,常与熟地黄、菟丝子、牛膝等药物配伍使用治疗骨关节疾病,为伤科常用之佳品[3]。现代药理学研究发现骨碎补主要化学成分为黄酮、三萜、酚酸及其苷类化合物[4];黄酮类化合物具有抗炎、促进成骨细胞分化及软骨细胞修复作用[5];而三萜类化合物具有免疫调节、促进骨形成作用[6];酚酸类化合物具有抗炎,抗氧化活性的作用[7]。因骨碎补对于骨科疾病具有良好的治疗效果,在临床中被广泛应用于治疗OA和骨质疏松等疾病。因此探讨骨碎补对于OA治疗的关键活性成分及潜在作用机制尤为重要。
  
  网络药理学是从系统生物学和生物网络平衡的角度,以“中药-基因-疾病”为关系网分析中药治疗疾病的作用靶点,进而推测出药物的作用机制的新兴研究方法[8]。分子对接是通过化学计量学方法模拟分子的几何匹配和能量匹配,可以推测出配体与受体的最佳结合模式[9]。本研究基于网络网络药理学和分子对接的方法,探析骨碎补治疗OA的潜在作用机制,以期对于OA疾病的治疗提供相应的参考。
  
  1.方法
  
  1.1关键活性成分收集
  
  以“骨碎补”为关键词在TCMSP系统(http://Lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)中查找中药骨碎补的组成成分及药物所含化学成分信息。按照口服生物利用度(OB)和药物相似度(DL)筛选骨碎补关键活性成分。口服生物利用度是指制剂中药物被吸收进入人体循环的速度和程度,药物相似度是指化合物与已知药物的相似性,这两者对于判断药物的活性成分具有重要意义,本研究根据以往研究标准,以OB≧30%,DL≧0.18作为筛选骨碎补关键活性化合物的标准。最终筛选得到共18个化合物,其中关键活性化合物13个。
  
  1.2构建骨碎补化学成分-靶点基因-骨关节炎疾病的网络
  
  通过TCMSP数据库查找骨碎补化学成分的蛋白作用靶点,采用Uniprot数据库(https://www.uniprot.org)查询蛋白所对应的基因,进行归纳总结,得到骨碎补关键活性化合物基因。同时借助Genecards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)、pharmGkb(https://www.pharmgkb.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、DrugBank(https://www.drugbank.ca/)数据库,以“Osteoarthritis”为关键词检索出与OA相关的基因,通过UniProt、HGNC、PubMed等数据库查询OA疾病靶标蛋白对应的基因名。将得到的骨碎补关键活性化合物基因和OA疾病基因结果输入R语言中获得交集基因及韦恩图。
  
  1.3PPI网络构建
  
  PPI网络为蛋白相互作用网络,其可以反映蛋白之间相互作用关系。将骨碎补与OA共同作用靶点基因导入string软件中(https://string-db.org/),隐藏游离蛋白,为清晰观察PPI网络关系,并逐步更改PPI蛋白评分关系数值,选取合适的并下载PPI蛋白互作关系图和tsv文件。
  
  1.4查找PPI网络核心(CytoNCA)
  
  将PPI网络的tsv文件导入Cytoscape软件中,构建可视化网络,并利用Network Analyzer 插件对网络进行分析,以各项评分高于中位值为筛选条件,筛选三次,最终确定PPI网络中核心蛋白。
  
  1.5相关信号通路网络构建
  
  采用R语言的Bioconductor生物学数据包进行基因GO功能和KEGG通路富集分析,按照统计学方法,将设置P设置为0.05,q设置为0.05 进行GO (gene ontology)生物学富集分析和KEGG通路富集分析,输出结果并绘制barplot柱状图和气泡图,最后分析结果讨论骨碎补对于OA的治疗机制。
  
  1.6分子对接分析
  
  通过pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、PDB(http://www.rcsb.org/)数据库下载小分子配体及蛋白受体的2D结构,利用PyMOL软件删除水分子和小分子配体、基于AutoDock软件准备PDBQT文件和确定活性口袋,最终利用Vina软件完成骨碎补活性成分与核心靶点的相互作用分子对接验证。
  
  2.结果:
  
  2.1.活性化合物的筛选
  
  利用TCMSP数据库搜索得到骨碎补的化合物共71种,通过OB≧30%,DL≧0.18的标准进行筛选,得到骨碎补的关键化合物18种,其中包括豆甾醇、β谷甾醇、山奈酚等成分。骨碎补关键活性化合物的信息详见表1。
  
  表1.骨碎补关键活性化合物成分
  
  2.2.骨碎补活性化合物靶点与OA疾病靶点交集基因
  
  通过Genecards、OMIM、pharmGkb、TTD、DrugBank数据库搜索与OA相关的靶点基因共1904个(如图1),将骨碎补与OA的靶点基因导入R语言中获得骨碎补-OA的共同靶点,并绘制韦恩图(如图2),记录共同靶点所对应的OA关键化合物,剔除无关化合物(22-Stigmasten-3-one、Cyclolaudenol acetate、cycloartenone、cyclolaudenol、marioside_qt)。最终得到与骨碎补-OA相关的关键化学成分13种,骨碎补-OA的共同靶点92个(详见表2)。以上靶点为相关信号通路的关键靶点。其涉及到炎性反应、氧化应激、细胞凋亡等多种生物学过程。
  
  图1.OA疾病基因数目
  
  图2.药物与疾病交集韦恩图
  
  表2. 骨碎补-OA的共同靶点
  
  2.3药物-疾病靶点可视网络构建
  
  将2.2中获得的交集基因和13种关键化合物导入Cytoscape软件中,构建药物-疾病可视化网络(如图3),网络中共105个节点(92个基因,13个关键化合物)和316个边。其中绿色三角表明13种关键化合物成分,分别为:(2R)-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chroman-4-one、Aureusidin、Eriodyctiol (flavanone)、Stigmasterol、beta-sitosterol、kaempferol、naringenin、(+)-catechin、eriodictyol、digallate、luteolin、davallioside A_qt、xanthogalenol。蓝色方框代表92个交集基因。在上述网络中,每一个节点的度值表示药物-疾病网络图中的节点之间相连的路线的条数。节点的度数越大代表其越有可能成为网络中的中枢节点。从化学成分来看,度数排名在前四的为:木犀草素luteolin(41)、山奈酚kaempferol(35)、柚皮素naringenin(23)、β谷甾醇beta-sitosterol(13)。从靶点的角度,度数前四的分别为PTGS2、PTGS1、ESR1、PPARG,其分别可以与13、10、5、5个化合物发生作用。在根据以上的网络的拓扑学性质进行分析中,可以发现骨碎补的关键的化合物可以对多个靶点具有调控作用,这种调控作用体现了药物靶点的多样性及生物网络的协同性。
  
  图3.骨碎补-OA可视化网络
  
  2.4蛋白质相互作用核心网络(PPICN)的构建与筛选
  
  将2.2中获得92个交集基因输入string软件中,最终确定PPI蛋白评分关系为0.9,得到图4,其中节点代表相关蛋白,每条边代表蛋白与蛋白互作关系,边数越多的蛋白表明其是核心蛋白的可能性越大,选取排名靠前的30个蛋白构建柱状图如图5,其蛋白名称分别为:TP53、AKT1、MAPK3、MAPK1、JUN、MAPK8、RELA、MAPK14、ESR1、RXRA、STAT1、BCL2L1、CASP8、CCND1、EGFR、NR3C1、BCL2、CASP3、NFKBIA、CDKN1A、VEGFA、CYP1A1、PRKCA、APP、AR、CDK1、CDK2、GSK3B、IL4、NOS2。这些蛋白对于OA的治疗起着关键的作用。
  
  图4.骨碎补-OA蛋白相互作用核心网络
  
  图5.骨碎补PPI网络前30名蛋白
  
  2.5查找PPI网络核心(CytoNCA)
  
  将2.4中得到的PPI网络导入,选取每一项评分大于中位值的蛋白,依次筛选三次(详见图6),最终得到PPI网络核心蛋白为:RELA、AKT1、TP53、ESR1、JUN、MAPK14、MAPK3、MAPK1,以上蛋白为PPI网络核心蛋白。
  
  图6.PPI网络核心(CytoNCA)
  
  2.6生物学(GO)富集分析结果:
  
  GO富集分析结果显示共获得114条GO生物过程,按照富集数目排名,排名靠前的主要为:磷酸酶结合(PPARG/MAPK14/BCL2/AKT1/STAT1/MAPK3/MAPK1/SOD1/HMGCR/PPARA/EGFR/TP53/ERBB2/MET),核受体活性与转录因子活性(ESR1/NR3C1/AR/PPARG/ESR2/RXRA/AHR/NR1I3/PPARA),蛋白磷酸酶结合(PPARG/MAPK14/BCL2/AKT1/STAT1/SOD1/HMGCR/EGFR/TP53/ERBB2/MET)和类固醇激素受体(ESR1/NR3C1/AR/PPARG/ESR2/RXRA/NR1I3/PPARA),图7为前10位GO生物学过程富集分析,通过此图可以看出骨碎补通过多种生物学调控达到治疗OA的效果。
  
  图7.骨碎补活性成分治疗OA关键靶点的GO生物学过程富集分析barplot柱状图
  
  2.7靶点通路分析(KEGG):
  
  通过靶点通路分析(KEGG)得到骨碎补治疗OA关键靶点基因主要富集在163条通路(P<0.05),提取前30个信号通路绘制barplot柱状图(如图8)和气泡图(如图9)。在163条信号通路中与OA关系密切的有34条信号通路,根据P值由小到大的排序绘制表3,表中涉及IL-17信号通路、细胞凋亡、PI3K-Akt等多种信号通路。这表明骨碎补治疗OA涉及不同信号通路的调控,且信号通路相互关联,这体现了信号通路间的协同性。
  
  图8.骨碎补治疗OA关键靶点富集信号通路barplot柱状图
  
  图9.骨碎补治疗OA关键靶点富集信号通路气泡图
  
  2.8分子对接验证:
  
  选取2.5中得到前三名的PPI网络核心蛋白(TP53、MAPK3、AKT1)与其对应的活性化合物成分,进行分子对接验证(如图10和表4)。分子对接结果表明,骨碎补与OA部分关键靶点蛋白分子对接吻合度较好,能够形成最佳复合体,且骨碎补可以通过调节TP53、MAPK3、AKTI等靶点发挥作用。
  
  图10.骨碎补治疗OA分子对接验证
  
  表4.骨碎补分子对接验证
  
  3.讨论:
  
  OA是威胁人类健康的常见病之一,在我国60岁以上人群中OA的发病率约为60%[10]。OA的发生发展变化与炎性反应、氧化应激、细胞凋亡等多种反应过程参与调控有关,且此过程大多为信号通路介导[11]。中药骨碎补为骨科常用药,具有良好的促增值分化、抗氧化、抗炎、镇痛等作用[12]。尚平等[13],研究发现骨碎补不仅能改善关节炎性状态,还可以提高关节活动度,促进疾病快速恢复。金连峰等[14],研究发现骨碎补可以明显抑制滑膜细胞中Fas、FasL因子的表达,达到延缓滑膜细胞退变的作用,推测这可能与抑制JNK信号通路有关。《本草正》中指出:“骨碎补疗骨中邪毒,风热疼痛,或外感风湿,以致两足痿弱疼痛”。《本草述》中也提到:“骨碎补治腰痛行痹,中风鹤膝风挛气证,泄泻,淋,遗精,脱肛。”[15]
  
  PPI蛋白互作网络可以得到与疾病关系密切的基因。本研究发现RELA、AKT1、TP53、ESR1、JUN、MAPK14、MAPK3、MAPK1与OA治疗关系密切,且这些蛋白都是相关信号通路的关键蛋白,在信号通路中扮演着极为重要的角色。GO富集分析显示这些靶点基因涉及磷酸酶结合、核受体活性与转录因子活性、蛋白磷酸酶结合、类固醇激素受体等。
  
  通过信号通路富集分析,得到34条与OA治疗相关的信号通路,其中包括炎性反应、细胞凋亡,微循环、骨代谢等多方面:(1)抑制炎性反应:包含IL-17信号通路、NF-κB信号通路、Wnt信号通路等。现代研究证实IL-17可以活化和调控血管内皮生长因子合成,加剧炎性反应,引发骨质纤维化增生[20]。而NF-κB信号通路可以调节软骨细胞的增殖与分化,研究发现当软骨细胞受到促炎因子刺激后,会促使IKK合成,引起ⅠκB水解,释放NF-κB,加重软骨损伤[21]。Toll样受体是一种模式识别受体,现代研究认为Toll样受体引起的固有免疫应答是促使OA发生的重要环节[22]。针对于Th17细胞分化通路,现代研究认为其可以通过刺激细胞分泌IL17,诱导核因子κB受体活化,达到促进破骨细胞的分化的作用[23]。NOD样受体又称为炎症小体,NOD样受体可以间接的激活MAPK信号通路,引起软骨细胞内基因的转录和修饰。导致关节基质的降解和关节炎性反应[24]。(2)改善氧化应激反应:FoxO信号通路在调控发育、老化、氧化应激等方面极为重要,当人体逐渐衰老时,软骨表面的FoxO表达会显著减少,这种减少可以促进炎性介质的释放,诱发软骨降解,加重骨性关节炎的症状[25]。(3)抑制细胞凋亡:PI3K/Akt、JAK-STAT、P53则与细胞凋亡有关。研究发现当PI3K及AKT磷酸化后可以使TSC1/SC2发生解聚,从而激活mTOR及下游转录因子,引起软骨细胞凋亡[26]。而JAK-STAT信号通路与多种生物学过程有关。当软骨细胞中JAK 受体与相应配体结合后活化,会激活STAT,引起相关目地基因的表达,促使发生凋亡反应[27]。P53是一种可以调节细胞生长的核磷酸化蛋白质,当在NO、IL-1β及机械应力等刺激下,会使关节软骨细胞中P53积聚、磷酸化,磷酸化后的P53会抑制DNA的复制,诱导关节软骨细胞凋亡,加速软骨降解[28]。(4)调控细胞自噬水平:主要与mTOR、AMPK信号通路有关。AMPK与mTOR信号通路间的相互作用是调控软骨细胞自噬的关键步骤。营养或生长因子的刺激都会使mTORC1活化,抑制ULK1的合成,进而破坏ULK1与AMPK 两者之间结合,抑制自噬反应。而在某些外界的刺激下,会促使AMPK通过直接激活ULK1,促进软骨细胞自噬反应,加剧软骨细胞的破坏[29]。(5)影响激素水平:多与甲状旁腺素、性激素、甲状腺激素、生长激素等有关。甲状旁腺素可以增加肾小管对钙的重吸收,促进骨的重建过程[30]。而雌激素可以直接作用于成骨细胞促进骨形成,也可以通过降钙素间接抑制破骨细胞活性[31]。生长激素可促进骨的生长和发育,甲状腺激素则可促进骨吸收过程,通过调节破骨细胞和成骨细胞的分化,减少软骨下骨的丢失,延缓关节软骨的病变,达到治疗OA的效果[32]。(6)改善微循环:其中包括HIF-1与VEGF信号通路。VEGF又称为血管内皮生长因子,是与微循环关系密切的细胞因子。HIF-1信号通路可以调控关节软骨表面深层氧分压,对于调控正常关节软骨细胞代谢、维持软骨细胞生存也起着重要的作用[33]。HIF-1α可以通过作用于软骨细胞中特异性激活位点促进VEGF的表达,影响微循环,改善OA症状[34]。(7)调节细胞因子:除了相关信号通路的调控,骨碎补还可以通过调控脂肪因子和趋化因子等相关细胞因子的合成,达到治疗OA的作用。现代医学认为肥胖是引起OA的诱因之一,其不仅可以加重OA患者机械负荷,还可以诱发软骨细胞凋亡和软骨基质降解[35]。而趋化因子能够促使促炎细胞到达损伤周围,加重炎症反应[36]。这两者都是促使OA疾病加剧的重要因素。
  
  网络药理学作为一个新兴的学科,可以对疾病的治疗提供指导作用,针对网络药理学所提供的关键靶蛋白和信号通路富集,仍需要课题组通过后续的实验研究对预测的靶点基因和相关通路进行实验验证,深入探究骨碎补对于治疗骨关节炎的机制。相信在不久的将来研究学者们能够探讨出对于骨关节炎治疗较为确切的作用机制。
  
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