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小分子AMPK直接激动剂的研究进展综述

更新时间:2020-07-10 08:21点击:

     摘要 2型糖尿病是一种慢性代谢性疾病,其主要表现为高血糖和微血管并发症,是影响人类生活的重大疾病.之一,目前尚无理想的治疗药物。腺苷酸活化蛋白激酶( AMP-activated protein kinase, AMPK) 是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在细胞和机体能量代谢与平衡等方面发挥重要作用:小分子 AMPK 直接激动剂因在降低血糖方面的作用而有望成为新一代治疗2型糖尿病的药物。本文按结构分类,对近几年报道的小分子AMPK直接激动剂进行综述。
 
    关键词 腺苷酸活化蛋白激酶;AMPK直接激动剂;构效关系: 2型糖尿病;新靶点;进展
 
 2 型糖尿病以葡萄糖和脂类的异常代谢为特征,导致骨骼肌、肝脏以及脂肪组织等部位的胰岛素抵抗和胰岛 β 细胞胰岛素分泌功能障碍,致使机体能量代谢失衡[1].目前,临床上用于治疗2 型糖尿病的药物,如双胍类( 二甲双胍) 、磺酰脲类( 格列美脲) 、二肽基肽酶-4( DPP-4) 抑制剂( 维格列汀) 、过氧化物酶体增殖物活化受体 γ( PPARγ)激动剂( 吡格列酮) 、α 糖苷酶抑制剂( 阿卡波糖) 、胰高血糖素样肽-1( GLP-1) 类似物( 利拉鲁肽) 等虽然具有较好的降糖疗效,但常伴随有诸如低血糖、体重增加、水肿、乳酸血症、胃胀气等不良反应[2].因此,寻找新的治疗糖尿病的作用靶点,开发更安全、更有效的降糖药物就显得尤为重要。腺苷酸活化蛋白激酶( AMPK) 在细胞及机体能量代谢平衡方面起着至关重要的作用,且有研究表明,临床上用于治疗 2 型糖尿病的一线药物,如二甲双胍等,也可以通过激活肝细胞 AMPK,从而抑制乙酰辅酶 A 羧化酶( acetyl-CoA carboxylase,ACC) 和诱导脂肪酸氧化达到降低血糖的目的[3].因此,AMPK 作为细胞的“代谢感受器”有望成为治疗 2型糖尿病的又一个新的药物作用靶点。本文对近几年小分子 AMPK 直接激动剂的研究进展进行综述。
  
  1 AMPK 的结构特点与活性调节
 
  1. 1 AMPK 的结构特点
 
  AMPK 是一种异源三聚体蛋白,由高度保守的α、β 和 γ 3 个亚单位组成; 其中,α 亚单位起催化作用,β 和 γ 亚单位主要起调节作用[4],每个亚单位都存在 2 ~ 3 种基因所编码的异构体( α1,α2,β1,β2,γ1,γ2,γ3) .α1 在细胞中广泛存在,而 α2在心肌、肝脏和骨骼肌中表达较高; β1 主要高表达于肝脏,而 β2 则在骨骼肌中表达较高; γ1、γ2 广泛存在于各种组织,而 γ3 仅在骨骼肌中含量较高[5].α 亚单位含有 548 个氨基酸,结构由 1 个丝氨酸/苏氨酸激酶区域( kinase domain,KD) 、1 个自抑制区域( autoinhibitory domain,AID) 、α-钩域( α-hook domain) 以及 1 个 β 亚单位结合域( β-bindingdomain) 组 成; 其 激 酶 区 域 内 的 苏 氨 酸 172( Thr172) 结合位点及其磷酸化对 AMPK 活性的调节起着至关重要的作用[6].β 亚单位主要由 1 个糖原结合域( glycogen binding domain,GBD) 和 α、γ亚单位结合域( α,γ-binding domain) 组成,主要起连接 α 亚单位和 γ 亚单位的支架作用。γ 亚单位则由 1 个 β 亚单位结合域和 4 个胱硫醚-β-合成酶( cystathionine-β-synthase,CBS) 串联重复序列组成的两个“贝特曼域”( bateman domain) 组成; 其中,CBS4 被 ATP 完全占据,CBS1、CBS3 可以结合 1 个AMP、ADP 或 ATP,CBS2 因缺少关键的天冬氨酸残基而空缺( 图 1)。
  
  1. 2 AMPK 活性的调节
 
  AMPK 作为一种重要的蛋白激酶参与多种代谢过程,其活性主要受 AMP/ATP 比值调控[8]; 任何引起机体 ATP 生成减少或者消耗增加的刺激,如组织缺血、缺氧、热休克、运动等,都可以激活AMPK.其激活机制一般认为有 3 种方式: ①直接作用于 AMPK,变构激活 AMPK; ②与 AMPK 结合之后使其成为上游 AMPK 激酶( AMPKK) 的良好底物,促进 Thr172 的磷酸化而激活 AMPK; ③降低Thr172 的去磷酸化程度[9].此外,AMPK 也可以被上游的 AMPK 激酶,如丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B1( serine / threonine protein kinase B1,LKB1) 、转化生长因子 β( TGF-β) 活化激酶-1( TGF-β-activatedkinase 1,TAK1 ) 、钙调蛋白激酶激酶 ( calmodulin-dependent protein kinasekinases,CaMKK) 直接激活,它们都是通过直接磷酸化 AMPKα 亚单位上的Thr172 而激活 AMPK( 图 2)[10].其中,LKB1 被普遍认为是一种抑癌基因,它可以直接磷酸 化AMPKα 亚单位上的 Thr172 而激 活 AMPK[11];TAK1 被广泛认为是一种 MAPKK-7( 促分裂原活化蛋白激酶激酶) ,其在 AMPK 活化通路中具有中枢般的调节作用[12]; CaMKK 主要存在于神经系统,其对 Thr172 的磷酸化不依赖 AMP 浓度的升高,而是通过调节细胞内钙离子的浓度而启动。另外,在静息状态下,AMPK 也可以被瘦素、抵抗素、脂联素、二甲双胍等激活[13].本文总结的 AMPK 小分子直接激动剂主要是通过对 α 亚单位 Thr172 的直接磷酸化而发挥作用。
 
  2 AMPK 在葡萄糖和脂类代谢中的作用
 
  2. 1 AMPK 在糖类代谢中的作用
 
  葡萄糖体内稳态的平衡由肝葡萄糖的生成和周围组织对葡萄糖的摄取两方面来维持( 图 3) .肝葡萄糖生成过量 ( hepatic glucose production,HGP) 是空腹高血糖的主要原因,且有研究表明,给予健康或胰岛素抵抗的 ob/ob 小鼠注射 AMPK激动剂 AICAR( 1) 致使肝脏 AMPK 激活、血糖浓度降低正是通过抑制 HGP 而实现的[14].AMPK 促进周围组织对葡萄糖的摄取主要通过诱导葡萄糖转运蛋白( GLUT) 向细胞膜转位以及磷酸化转录因子从而开启 GLUT 基因的表达来完成的[15].另外,磷酸果糖激酶( phosphofructokinase,PFK) 是糖酵解的限速酶,AMPK 活性增加时,PFK2 活性和2,6-二磷酸的含量明显增加。体外纯化的 AMPK可磷酸化 PFK2 也进一步证明了 AMPK 在糖酵解方面的促进作用。在肝细胞实验中,活化的 AMPK不仅通过抑制6-磷酸果糖-2-激酶、L 型丙酮酸激酶等促进葡萄糖酵解,还能通过抑制果糖 1,6-二磷酸激酶抑制糖异生[16].总之,AMPK 通过调节肝葡萄糖的转化和增强周围组织对葡萄糖的摄取和利用,从而维持机体糖代谢的稳定。
  
  2. 2 AMPK 在脂类代谢中的作用
 
  乙酰辅酶 A 羧化酶( ACC) 和羟甲基戊二酸单酰辅酶 A 还原酶( HMGR) 分别是脂肪酸和胆固醇合成的关键酶。ACC 是脂肪酸合成的限速酶,糖代谢生成的乙酰辅酶 A 可在 ACC 作用下合成丙二酰辅酶 A,后者又可以通过负反馈抑制肉毒碱棕榈酸转移酶-1( CPT-1) 的活性,从而抑制线粒体的脂肪酸氧化以及酮体的生成; 而 HMGR 为胆固醇合成的限速酶,可催化羟甲基戊二酸单酰辅酶 A 生成甲羟戊酸。ACC 和 HMGR 均为 AMPK 的重要底物,活化的 AMPK 能够使两者磷酸化失活,从而分别抑制胆固醇和脂肪合成[17].此外,脂肪酸氧化是肌肉组织能量来源的重要方式,AMPK 的激活可以通过磷酸化作用抑制 ACC,减少丙二酰辅酶 A的合成,负反馈增强 CPT-1 的活性以及脂肪酸的氧化。因此,AMPK 的激活既降低了胆固醇和脂肪的合成,又增强了脂肪酸的氧化作用,表明其在脂类代谢调节方面具有重要的作用。
 
  3 小分子 AMPK 直接激动剂
 
  AMPK 在血糖调节方面的突出表现,使其成为寻找新型降血糖药的热门靶点。自 2005 年由Abbott 实验室通过计算机高通量筛选并进行结构优化 得 到 第 1 个 小 分 子 AMPK 直 接 激 动 剂A-769662( 5 ) 以 来,各制药公司一直将小分子AMPK 直接激动剂作为调节血糖药物研究的重点;目前尚无小分子 AMPK 直接激动剂作为降血糖药物上市,但不断有新的药物进入临床试验( Ⅰ/Ⅱ期临床 1 个; Ⅱ期临床 2 个) .现根据文献报道的小分子 AMPK 直接激动剂的结构类型进行综述。
 
  3. 1 阿卡地新( acadesine,AICAR)
 
  化合物 AICAR( 1) 是 1956 年从受磺胺类药物抑制的大肠杆菌中分离出来的结晶化合物[18].该化合物的 5-羟基在体内被腺苷激酶磷酸化后转化成化合物 ZMP( 2)[19],后者于 1994 年经Sullivan 等证实具有较好的 AMPK 激动活性,且与AMPK 亲和力较之 AMP ( 3 ) 更强; 激活机制与AMP 相同,都是通过绑定 γ 亚单位上的 CBS1 或CBS3 结合位点而变构激活 AMPK[20],但不同之处在于 ZMP 激活 AMPK 过程并没有检测到明显的 AMP/ATP 比 值 的 变 化,这 使 其 成 为 研 究AMPK 的理想探针[21].啮齿动物实验研究表明,AICAR 可以激活不同组织的 AMPK,而且同时促进 GLUT 向细胞质膜的转运[22]; 临床前实验研究表明,AICAR 可以明显降低血糖浓度,提高口服糖耐量[23].截至 2015 年 1 月,该化合物正由Merck&Co. 公司进行Ⅰ / Ⅱ期临床研究。
 3. 2 噻吩并吡啶酮类( thienopyridones)
  2015 年,Abbott 实验室通过计算机高通量筛选得到了非核苷类 AMPK 小分子直接激动剂A-5921074 ( 4,大鼠肝脏 AMPK EC50= 38 μmol / L) ,在此基础上进行结构优化得到化合物 A-769662( 5,大鼠肝脏 AMPK EC50= 0. 8 μmol / L).研究 表 明: A-769662 通 过 降 低 α 亚 单 位Thr172 的去磷酸化程度而变相激活 AMPK,并且不会与现有已知的所有 AMPK 亚单位的任何位点结合[25],而 且 A-769662 只 对 含 有 β1 亚 单 位 的AMPK 有激活作用。Xiao 等[26]通过 AMPK 亚型α2β1γ1 与 A-769662 的共晶作用证实,A-769662的作用位点位于 α 亚单位激酶区域( KD) 与 β 亚单位的糖原结合域( GBD) 之间。通过 ob/ob 小鼠每天两次剂量( 30 mg/kg) 给药实验结果显示: A-769662可以明显降低血糖和肝脏甘油三酯水平,并可以抑制脂肪酸合成和促进脂肪酸的利用[24].该化合物由 Abbott 实验室推上临床,希望藉此更深入地探索 AMPK 的结构功能特点,并得到活性更加优良且成药性好的 AMPK 小分子激动剂。
 
  3. 3 吡咯并吡啶酮类( pyrrolopyridones)
 
  化合物 A-769662 作为小分子 AMPK 直接激动剂进行临床研究时,口服生物利用度并不理想。故而 2011 年 Glaxo Smith Kline( GSK) 公司的 Mirguet等[27]以提高口服生物利用度和选择性为目的设计合成了一类吡咯并吡啶酮类化合物。其中,化合物6 具有较好的口服生物利用度,但是仍具有较高的血浆清除率。在此基础上,对 R2、R3位置替换以不同的基团得到了一系列小分子 AMPK 直接激动剂,构效关系研究表明: ①R3为氰基时,因为化合物本身的酸性,其细胞膜渗透性较差,引入芳香羧酸基团取代氰基,AMPK 激动活性明显增强[7];② 2‘位引入吸电子基团( 如 F、Cl 原子) 时,口服利用度显着提高,然而血浆清除率和细胞膜渗透率却并不理想,与 P 蛋白阻断剂合用可以明显降低血浆清除率[27].此外,该类化合物对大多数 AMPK亚型都有激活活性; 其中,化合物 8 ~11 于 2012 年8 月进入临床前期试验阶段。2012 年,GSK 又对专利做了进一步补充,设计并合成了吡咯并嘧啶酮类( 化 合 物 7) ,也 显 示 出 一 定 的 AMPK 激 动活性[28].
  
  3. 4 苯并咪唑类( benzimidazoles)
 
  自 2010 年起,Merck 和 Metabasis Therapeutic公司发表了数篇专利,用于保护具有 AMPK 激动活性的一系列苯并咪唑类化合物( 表 1)[29-32],活性评价以半数有效浓度( EC50) 和 AMPK( α1β1γ1)最大激活率( Actmax) 为指标。此类化合物结构修饰主要在母核的 2’、5‘、6’位置,5‘位取代基的改变对活性有很大影响; 有趣的是该类化合物保留了化合物 A-769662( 5) 3 位的 4-( 2-羟苯基) 苯基片段,且显示十分优异的活性。之后,Merck 公司做了对专利的进一步补充,主要在 4’位和 6‘位引入氟原子,化合物活性基本保持或有所增强。构效关系研究表明: ①6’位引入吸电子基团( 如 F、Cl) 时活性提升明显; ②5‘位基团是芳香( 杂) 环类化合物时AMPK 激动活性显着; ③ 2’位连接位阻较大且带有羧酸的药效团时活性优异。该类化合物因体外活性优异而备受关注,目前,该公司研究人员正展开对其进行生体内活性测试的进一步研究; 自 2010年 10 月至今,已有 19 个苯并吡唑类化合物进入生物活性测试阶段。
 鉴于苯并咪唑类化合物表现出十分优异的AMPK 激动活性 ( 如化合物 12,EC50= 3 nmol / L,Actmax= 241% ) ,Xiao 等[26]通 过 化 合 物 12 与AMPK( α2β1γ1) 的共晶结构和模拟对接进一步阐释了该类化合物与 AMPK 的主要作用方式: ①化合物12 与酶的作用位点位于由 α 亚单位激酶区域( KD) 与 β 亚单位糖原结合域( GBD) 组成的间隙疏水口袋,主要容纳化合物 12 的 A、B 环体系( 图4) ; ②C 环伸展在疏水口袋右侧的开口亲水区域,伸展空间较大,且该部分对 AMPK 最大激动率( Actmax) 的大小有重要影响; ③与关键氨基酸( 如Lys29、Asp88、Arg83 等) 存在重要作用力( 如氢键作用、碱基堆积力等) .这为 AMPK 小分子激动剂的结构设计提供了可靠的思路和依据。
  之后,日本 Shionogi 公司就以苯并咪唑类化合物结构为基础,利用电子等排原理,仅用 6 个月的时间设计并合成了吡啶并咪唑类约 450 个化合物( 表 2)[33-36],此类化合物在 2‘位( R1) 和 5’位( R3)引入大量天然基团,其中部分化合物在分子水平的AMPK 激动活性较之苯并咪唑类表现更为突出( 如化合物 19,α1β1γ1EC50= 0. 38 nmol / L,Actmax=660% ) .Merck 公司后期也对该类化合物做了专利补充,部分实施例有所重复。自 2013 年 2 月至今,Shionogi 公司共筛选 28 个吡啶并吡唑类化合物进行生物活性测试,Merck 公司同样筛选了 13个化合物展开药理实验研究,暂时未见更新报道。
 
  此外,Merck 公司进一步对氮杂吲哚类化合物作了专利补充( 表 2) ,其主要药效团未作改变,并筛选了 4 个化合物进入生物活性测试阶段。
 
  3. 5 吲哚酸类( indole acids)
 
  同样是在苯并咪唑及其衍生类 AMPK 小分子激动剂结构公开之后,Pfizer 公司通过分子模拟对接设计并合成了一系列吲哚酸类化合物[37],分子水平活性测试显示该类化合物对 AMPK α1β1γ1亚型具有明显的激动作用( 如化合物 23,EC50=1. 7 nmol / L,Actmax= 68% ) ,然其 AMPK 最大激动率普遍较低。通过分子对接,比较化合物 23( 黄色) 与 12( 绿色) 的空间构象发现: ①左侧环系以及母核在疏水口袋的伸展并没有发生明显变化; ②化合物 23 与 12 空间重叠性好,且与 Lys29、Arg83 以及 Asp88 的关键氢键作用都得以保持; ③吲哚酸类缺失的右侧环系对 AMPK 最大激动率的大小有重要影响( 图 5 和图 6) .Pfizer 公司于 2014 年 5 月筛选出 8 个吲哚酸类 AMPK 小分子直接激动剂进行生物活性测试。
  
  3. 6 噻唑烷酮类( thiazolidones)
 
  针对 非 激 动 状 态 的 α1 亚 单 位 片 段 ( 1-394AA) ,Pang 等[38]通过对 3 600 个化合物进行活性筛选,得到小分子 AMPK 直接激动剂 PT1( 24,α1β1γ1,EC50= 8 μmol / L) .PT1 对于切除 α1 亚单位自抑制区域( AID,312 ~ 392AA) 的 AMPK 并没有激活作用; 共晶结构及对接研究表明,PT1 镶嵌在 α 亚单位激酶区域( KD) 与自抑制区域( AID)之间的间隙,通过与 AID 附近的 Glu96 和 Lys156等氨基酸的氢键作用使该区域构象变得松散而激活 AMPK.实 验 证 明,PT1 只 选 择 性 地 激 活AMPKα 亚单位,且是 AMPK 的直接激动剂,并不导致 AMP/ATP 比值变化; 然而由于该化合物生物利用度较差,体内并没有检测到明显的 AMPK 激动活性[39]; 故而以其为先导化合物不断进行结构优化,将 2-氨基-4-噻唑烷酮替换为 3-烷基吲哚酮得到化合物 25( EC50= 2. 1 μmol / L) ,AMPK 激动活性明显增强; 进一步优化得到化合物 26( EC50<2 μmol / L) ,通过 4 周 db / db 小鼠经口给药,与二甲双胍相比可以明显降低血浆甘油三酯水平和提高葡萄糖耐受性[40]; 之后,由 Roche 公司开发的一系列烷基吲哚酮类化合物用于食源性肥胖或者 2 型糖尿病的治疗。化合物 PT1 于2013 年9 月进入临床前期试验,未见更新报道( 图 7) .最近,由 Boehringer Ingelheim 公司与印度生物技术公司 Connexios Life Sciences 合作开发的用于治疗 2 型糖尿病的 AMPK 小分子激动剂 CNX-012-570 ( α1β1γ1,EC50= 93 nmol / L; α2β2γ3,EC50=285 nmol / L) 进入临床前研究阶段[41],该化合物结构未予公开。但由近期 Boehringer Ingelheim 公司发表的专利显示,其结构可能与 PT1 类( 27) 和苯并咪唑类( 28) 有很大相似性( 化合物 29) ,虽然PT1 与苯并咪唑类的 AMPK 激动机制完全不同。
 
  动物实验显示,CNX-012-570 不仅提高机体胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性,而且明显降低血浆甘油三酯和血糖水平。此外,另有 13 个该类化合物于2015 年 1 月进入生物活性测试阶段。
 
  3. 7 其他类
 
  除上述 AMPK 小分子激动剂结构外,文献报道了 如 2-氨 基 噻 唑 类 ( 30,Actmax= 109. 09% /10 μmol / L)[42]、吡啶酰胺类( 31,EC50< 0. 1 μmol /L)[43]等也具有 AMPK 激动活性,以这些结构为先导化合物的构效关系讨论或生物活性测试也正在进行中。
  
  4 结 语
 
  AMPK 在细胞和机体能量代谢平衡维持方面的重要作用,使之成为代谢性疾病( 如糖尿病、肥胖症等) 治疗药物的研究靶点。多家制药公司竞相开发其小分子激动剂,已初步取得满意的效果。
 
  尽管目前尚无此类药物上市,但是随着不同结构的AMPK 小分子激动剂与 AMPK 之间的结合方式、AMPK 上游调控蛋白结构和功能以及对机体代谢影响机制的进一步阐明,以 AMPK 为靶点的新一代抗糖尿病药物终将研发成功,为人类健康带来福音。

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