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小檗碱干预下肢动脉硬化闭塞症的网络药理学研究

更新时间:2020-10-16 08:22点击:

摘    要:
目的 利用网络药理学研究方法预测小檗碱(BBR)干预下肢动脉硬化闭塞症(ASO)的作用机制。方法 利用TCMSP数据库、CTD数据库,挖掘BBR的作用靶点,通过DisGeNET、GeneCards、OMIM等数据库筛选出ASO的靶标。运用Cytoscape软件构建BBR干预ASO的“成分-靶标-疾病”网络,通过STRING数据库构建靶点蛋白相关作用网络并进行关键靶点的生物功能注释及通路分析。结果 BBR可以通过干预163个靶点、155条通路干预ASO。结论 BBR可能通过抑制炎性反应、保护内皮细胞等药理作用干预ASO。
 
关键词:
小檗碱 网络药理 下肢动脉硬化闭塞症 有效成分 靶点
下肢动脉硬化闭塞症(atherosclerosis obliterans,ASO)是以下肢发凉、怕冷、麻木为主要临床特点的缺血性疾病,缺血严重者可出现溃疡,甚至截肢。在药物治疗方面,西医主要采取抑制血小板聚集、抗凝、调节血脂等方式治疗ASO。随着现代药理学的发展,中药及其单体有效成分的研究愈加深入。小檗碱(berberine,BBR)是中药黄连的有效成分,现代研究证实,BBR具有抗动脉粥样硬化的作用,但其具体作用机制尚不明确[1-2]。网络药理学(network pharmacology,NP)是指在系统生物学(systems biology,SB)的理论指导下,运用“药物成分-作用靶点-信号通路-治疗机制”的网络构建手段,从新的角度认识药物与疾病之间的相互作用并指导新药研发的新兴学科[3]。NP可以通过构建“中药有效成分-作用靶点-信号通路-治疗机制”的网络,可以直观地展现中药有效成分治疗相关疾病的途径和通路,有助于推动中药药效的物质基础和分子机制的研究。本研究在网络药理学理论的指导下,探讨BBR干预ASO机制,构建“成分-靶标-疾病”的网络,旨在为ASO的临床治疗及机制研究提供理论支持。
 
1 方 法
1.1 BBR作用靶点的获取及收集
利用西北农林科技大学设计开发的中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)中的“靶点预测”功能以及比较基因组数据库(Comparative Toxicogenomics Database,CTD,http://ctdbase.org/)收集BBR的作用靶点。登陆蛋白质数据库UniProt(http://www.uniprot.org/),导出物种为“人”的UniProt KB数据,利用perl语言工具(http://www.perl.org/)校正预测的靶点名称。
 
1.2 ASO靶点的获取及收集
DisGeNET(http://www.disgenet.org/)数据库是最大的包含人类疾病及相关基因靶点的数据库之一,包含17 549种基因和24 166种疾病。GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库是一个可以分析人类基因数据的综合数据库,其主要功能包括分析基因的表达、功能途径、蛋白质与蛋白质的相互作用、基因与疾病的关系等。人类在线孟德尔遗传平台(OMIM,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)是一个记录所有已知疾病的遗传成分,并预测它们与人类基因组中相关基因的关系的数据库。使用上述3个数据库,检索获取与ASO相关的靶标基因。合并3个数据库检索到的数据,去重后,运用R语言(https://www.r-project.org/)将BBR作用靶点和ASO靶点取交集,获得BBR干预ASO的靶点,并绘制韦恩图。
 
1.3 成分-靶点网络的构建
将BBR作用靶点和ASO靶点取交集,获得的靶点基因即为BBR干预ASO的关键靶点。使用Cytoscape 3.7.1软件(http://www.cytoscape.org)构建“成分-靶点”关系网络。网络中的节点(Node)代表BBR、ASO与关键靶点;边(Edge)代疾病-靶点、成分-靶点之间的连接。整个网络构建并展示了成分-靶点之间的联系,通过这一网络可以深入分析BBR干预ASO的作用机制。以网络节点度值(Degree)和中介中心度(Betweenness centrality)为筛选条件,挖掘网络核心节点。
 
1.4 关键靶点蛋白相关作用(Protein-Protein Interaction,PPI)网络的构建
使用STRING数据库(https://string-db.org)预测蛋白质之间的相互作用。STRING数据库系统可对通过不同方式获得的预测结果进行评分,分值越高,表示PPI结果的置信度越高。本研究利用STRING数据库的“Multiple Proteins”功能,设定“物种”为人类(Homo Sapiens),将BBR干预ASO的关键靶点导入系统检索,设定评分分值>0.9,即可构建PPI网络,并获得节点度值等反映靶标蛋白相互关系的信息。
 
1.5 关键靶点的生物功能注释及通路分析
Bioconductor是目前最常用的,以R语言为平台的高通量基因组数据分析工具之一,该工具为高通量基因组数据提供了多种分析和理解方法,同时提供了包含人类在内的19个物种的GO注释信息。ClusterProfiler是常用的基因数据分析的R语言工具之一,可利用Bioconductor提供的GO注释信息和KEGG pathway数据库(http://rest.kegg.jp/link/hsa/pathway)进行信号通路富集分析,其可视化功能特点突出。本研究利用perl语言工具将BBR干预ASO的关键靶点名称转换为Entrez ID,运用上述工具,以P<0.05为条件,进行信号通路富集分析,并将富集结果可视化。
 
2 结 果
2.1 BBR干预ASO的潜在作用靶点预测 通过 TCMSP数据库中的靶点预测模型以及CTD数据库检索,汇总并去重后,得到BBR的作用靶点254个。通过DisGeNET 数据库、GeneCards平台和OMIM平台共收集ASO相关靶点基因,合并去重后获得疾病靶点基因3 771个。运用R语言“VennDiagram”程序包将BBR作用靶点和ASO相关靶点取交集,获得BBR干预ASO的靶点,绘制维恩图(见图1),获得共同基因163个,表明BBR可通过多个靶点干预ASO。
2.2 成分-靶点网络构建 本研究共获得BBR干预ASO的作用靶点163个。利用网络图形化工具Cytoscape 3.7.1对BBR干预ASO的作用靶点进行关系网络绘制和统计,见图2。
2.3 BBR干预ASO靶标蛋白PPI网络分析结果登陆STRING数据库,上传BBR干预ASO的靶点,设定置信度评分分值>0.9,将独立于网络之外的蛋白予以排除,得到BBR干预ASO的靶标蛋白PPI网络(见图3)。该网络共包含节点161个,边787条,平均度值为9.78。网络中的“节点”代表靶标蛋白,“边”表示靶标蛋白间的相互作用关系。边数越多表示该节点对应的靶标蛋白在网络中的作用越重要。运用R语言抽取网络中的关键靶标蛋白的信息条形图(见图4)。结果表明,AKT1、TP53、IL6等度值较高,说明这些靶点在网络中的作用显著,是和其他靶点互通的纽带。
2.4 关键靶点基因生物功能及通路分析 以R语言为平台,运用“clusterProfiler”程序包,利用Bioconductor提供的GO注释信息和KEGG pathway数据库进行信号通路富集分析。GO注释结果显示,BBR潜在关键靶点富集显著的前5个生物学功能主要为RNA聚合酶II转录因子结合(16个靶点),磷酸酶结合(17个靶点),血红素结合(15个靶点),细胞因子受体结合(20个靶点),四吡咯结合(15个靶点),表明BBR可以通过调控多种生物学途径干预ASO(见图5)。KEGG通路富集得出155条结果,有137条通路的P<0.01。以P值和基因的数量为筛选条件,取前20位的通路进行分析,结果表明基因显著富集在PI3K-Akt信号通路、AGE-RAGE信号通路、FoxO信号通路等通路上,见图6。
3 讨 论
本研究通过对BBR干预ASO“成分-靶点”网络分析发现,AKT1、TP53、IL-6等靶标蛋白是整个网络的核心节点,提示这些节点是BBR干预ASO的关键靶标。AKT1属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族,它参与许多过程的功能,包括代谢、增殖、细胞活性、生长和血管生成等方面,能通过介导胰岛素诱导的SLC2A4/GLUT4葡萄糖转运蛋白向细胞表面的转运来负责调节机体对葡萄糖的摄取,对于维持血糖稳定具有重要作用[4]。李雅婷[5]研究发现,在胰岛β细胞中,糖化血清可以增加TP53转录活性,激活下游信号通路,诱导β细胞凋亡;干扰TP53转录可以对糖化血清引起的胰岛β细胞凋亡起保护作用,表明TP53在糖尿病发病过程中扮演重要角色。IL-6是炎症反应的重要调节因子,参与动脉硬化的发病进程[6]。研究证实,IL-6可以诱导巨噬细胞产生人单核细胞趋化因子1(MCP-1),诱发单核细胞在血管内皮下聚集,参与斑块形成[7]。MCP-1又可以诱导白细胞产生IL-6等炎性媒介,提高血管内皮细胞ICAM-1和VCAM-1的表达水平,导致血管内皮分泌MCP-1等炎性趋化因子,形成恶性循环,加速动脉硬化发病[8]。
 
KEGG通路富集结果表明,基因显著富集在AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、FoxO信号通路等通路上。研究证实,使用慢病毒沉默RAGE后,血管平滑肌细胞钙化显著减少,而AGEs可激活RAGE表达[9]。研究证实,AGEs可通过上调P-ERKI/2、P-P38等表达,诱导HASMCs成骨表型OPG、OPN等表达,诱导细胞钙化[10]。此外,研究发现,RAGE可以通过激活 NF-κB 和 NADPH 氧化酶促使ROS产生,进而导致IL-1、IL-6等促炎性细胞因子和VCAM-1等黏附分子产生,激活巨噬细胞和血小板功能,诱导血管病发生[11]。Pl3K/Akt信号通路,也称磷脂酰肌醇三激酶-蛋白激酶B信号通路,是人体细胞内重要信号调控通路之一,与细胞的生长、分化和增殖等病理生理过程密切相关。近年来,该通路与内皮细胞动员、分化以及抗凋亡作用的相关性成为研究热点。有文献报道[12],Pl3K/Akt信号通路可参与血管内皮细胞生长因子(VEGF)的分泌调节,并完成对血管及血管内皮细胞凋亡的控制。血管内皮细胞的功能可以受到氧化应激反应或者炎性反应的影响而出现紊乱,诱导TXA2和内皮素等合成增多,上调FoxO1的表达,进而降低内皮细胞的成血管能力[13]。研究证实,麝香通心滴丸可以通过调控TLR2/4受体的途径,下调FoxO1表达,进而诱导 CD11b表达下调,改善模型小鼠的外周微循环[14]。
 
综上所述,本研究运用网络药理学的研究方法,对BBR干预ASO的机制进行挖掘,结果表明,BBR可能通过调控AKT1、TP53、IL-6等基因,介导AGE-RAGE信号通路、PI3K/Akt信号通路、FoxO信号通路等发挥抑制炎性反应、保护内皮细胞等药理作用。上述结果可为BBR干预ASO的机制研究提供新的思路。但由于目前数据库收集的信息尚不全面,药物有效成分及其靶点的筛选过程会受到研究者的主观态度影响,而且药物有效成分在体内的代谢过程也存在诸多影响因素,本研究的结果会存在一定的局限性,BBR干预ASO的机制有待进一步实验验证。
 
利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。
 
参考文献
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