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基于网络药理学探讨开心散防治阿尔兹海默症的作用靶点和作用机制

更新时间:2020-10-26 08:09点击:

摘    要:
目的:基于网络药理学探讨开心散(KXS)防治阿尔兹海默症(AD)的潜在作用靶点和作用机制。方法:应用中药综合数据库(TCMSP)及BATMAN-TCM分析工具筛选出开心散的活性成分及作用靶点,检索与疾病靶点有关的数据库GeneCards、OMIM筛选AD的作用靶点,进而筛选开心散与AD的交集核心靶点,并运用Cytoscape3.7.1软件构建化合物-靶点-疾病网络,利用R包对靶点进行GO功能富集和KEGG通路富集分析。结果:筛选得到开心散中47种化学成分和443个靶点与AD相关,成分-靶点网络图显示成分与疾病靶点可能通过 AKT1,JUN,MAPK14,MAPK8,RXRA,RELA,EDN1与NR3C1等关键基因,经由精氨酸生物合成、神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路、cAMP 信号通路、IL-17信号通路等通路发挥治疗作用。结论:基于网络药理学初步探讨并验证开心散防治AD以“多成分-多靶点-多途径”为整体调节作用特点,预测开心散防治AD的潜在作用机制,以期为其活性成分研究与实验研究提供科学依据。本研究通过预测开心散防治AD的潜在靶点,揭示开心散治疗AD的作用机制。
 
关键词:
阿尔兹海默症; 开心散; 网络药理学; 作用靶点; 作用机制
 
阿尔茨海默病(AD)是痴呆的一种常见类型,约占痴呆的50%~60%,是一种与年龄相关的神经变性疾病,它的特点是进行性认知障碍,包括判断、决策和定向障碍,该病在后期常伴有心理行为障碍和语言障碍[1],其典型的病理表现是淀粉样β(Aβ)斑块、神经纤维缠结(NFT)、神经元死亡和突触丢失以及大脑炎症[2]。当今治疗AD的临床药物多为单一靶点,不良反应大,而中药复方不良反应小, 可发挥整体效应,在AD治疗方面有重要研究价值[3]。
 
开心散,始见于《千金方·备急千金要方》,由人参、茯苓、远志和石菖蒲组成,是古代沿用至今的经典名方。其中,远志宁心安神,祛痰开窍,用于痰阻脑窍;人参能补五脏,止惊悸,开心益智;石菖蒲豁痰开窍,理气活血,用于痰湿秽浊之邪蒙蔽清窍;茯苓利水渗湿,健脾安神。诸药合用共奏益气安神、化痰开窍益智之效[4]。最新的临床研究显示,开心散有改善老年记忆障碍、认知功能障碍及语言障碍等神经精神疾病的作用,并且对阿尔茨海默症有潜在的治疗作用[5]。
 
生物体是一个复杂的网络生物系统。一些疾病是由多个基因或蛋白质的表达改变而引起的。然而,针对单一靶点设计的药物并不能有效治疗这些复杂的疾病[6]。网络药理学是系统网络分析与药理学相结合的一种新方法。基于现有的生物数据,可建立靶-疾病、化合物-化合物和化合物-靶相互作用的网络,以识别潜在的药物靶点并阐明药物的作用机制。本研究旨在运用网络药理学方法,探讨KXS与AD的主要物质基础、核心靶点及可能的关系,为进一步阐明其作用机制提供思路和理论依据。
 
1 材料与方法
1.1 开心散活性成分筛选
本研究应用中药综合数据库TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)及BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)分析工具,以“人参”“茯苓”“远志”“石菖蒲”为检索词,检索开心散的全部有效成分,选择类药性(drug-likeness, DL)>0.18,口服生物利用度(oral bioavailability,OB)>30%或Score cutoff≥20作为筛选参数,得到复方开心散的有效成分Ingredients文本。其中OB值代表制剂中药物被吸收进入人体循环的速度与程度,其反映所给药物进入人体循环的药量比例;DL值代表化合物与已知药物的相似性。然后把四味药的相关靶点都下载到Related Targets文本,结合前面有效成分的数据,通过perl脚本,得到符合条件的有效成分靶点。利用疾病靶点标准化数据库Uniprot(http://www.uniprot.org/),上传药物潜在靶点与疾病相关靶点的名称(target name),蛋白种属设置为“Homo sapiens(Human)”,获取其靶点的标准基因名。
 
1.2 AD相关靶点预测
本研究以AD的医学主题词(MESH)Alzheimer's Disease为关键词,通过检索GeneCards(https://www.genecards.org/), OMIM(https://omim.org/)数据库,得到两数据库的并集基因,以获得目前已知的与AD相关的人类基因。
 
1.3 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建及关键靶点筛选
构建蛋白质-蛋白质相互作用关系(protein-protein interaction, PPI)网络已经成为寻找靶点和靶点间直接及间接作用关系的重要方法。本研究采用Draw Venny Diagram在线程序(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)将Disease和Drug靶基因取交集获得复方与疾病的共同靶点文件,并生成韦恩图,然后通过运行prepareCyto.pl脚本,得到molLists、network、type三个文本文件,为后续Cytoscape网络图做准备文件,并将得到的靶点数据上传至String数据库(https://string-db.org/)中构建PPI图,设置minimum required interaction score为medium confidence: 0.900,其余参数为系统默认值,对靶点进一步筛选。
 
1.4 化合物-靶点-疾病网络构建
将筛选后的关键靶点文件上传至Cytoscape 3.7.1软件生成化合物-靶点-疾病网络图,以证明开心散在多靶点,多途径上具有治疗AD的作用。具体操作步骤如下1)点击File-Import-Network-File导入network文件;2)点击File-Import-Table-File导入type文件;3)点击Select-Nodes-From ID List File选取Drug_Disease文件,就可选取基因进行后续操作;4)点击Select-Nodes-From ID List File选取molLists文件,就可选取中药有效成分进行后续操作。点击Style,分别选取,根据自己的需要对网络图进行调整;选择File-Export as Image可保存图片。
 
1.5 对核心靶点进行GO注释分析和KEGG通路分析
为了深入了解上述筛选出的核心基因的功能以及在信号通路中发挥的作用,本研究利用利用R3.6.0软件,安装RSQLite包及org.Hs.eg.db包,将gene symbol生成对应的gene ID,以便为后续分析做准备。
 
GO分析:利用R3.6.0软件,安装Bioconductor的colorspace、stringi、DOSE、clusterProfiler、pathview、ggplot2等程集包,在R软件中运行gene ID,得到全部的GO生物过程结果,选取统计学最显著的前20的GO生物过程,利用GO plot R package将得出结果的可视化。富集结果采用柱状图和气泡图的形式展现。其中,不同颜色节点代表不同类型富集结果,而其大小与显著程度呈正相关。
 
KEGG分析:利用R3.6.0软件,安装Bioconductor的colorspace、stringi、DOSE、clusterProfiler、pathview等程集包,在R软件中运行gene ID,得到全部的KEGG生物过程文件,选取统计学最显著的前20的KEGG生物过程,来进行KEGG(KEGG pathway analysis)代谢通路富集分析,将得出KEGG分析的可视化结果,富集结果采用柱状图和气泡图的形式展现。
 
2 结果
2.1 活性化合物及靶点的筛选
本研究通过TCMSP数据库及BATMAN-TCM分析工具,DL>0.18,OB>30 %或Score cutoff≥20为筛选条件,共筛选出活性化合物47个,经过筛选后共得到443个药物潜在靶点,活性化合物基本信息,见表1。开心散各药物的活性化合物交集韦恩图,见图1。
2.2 AD相关靶点检索
通过检测GeneCards、OMIM数据库,检出与AD相关的已知靶点分别为8974个,267个,删除重复靶点后共纳入9078个与AD相关的靶点。
 
2.3 PPI网络构建及核心靶点筛选
利用R语言VennDiagram数据包得出开心散潜在靶点和AD相关靶点交集,生成韦恩图,见图2,蓝色代表AD相关靶点,红色代表开心散潜在靶点,由此筛选到成分与疾病共有靶点163个蛋白,主要涉及诱导型一氧化氮合酶(NOS2);内皮型一氧化氮合成酶(NOS3);丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1);白细胞介素 1β(IL1β);细胞凋亡相关蛋白(BAX,BCL2,CASP9,CASP3,CASP8)等。
将163个交集核心靶点上传至STRING以构建PPI网络,图中网络节点表示靶点蛋白,每条边表示蛋白质与蛋白质之间的相互作用关系,两个节点之间,线条越多表示之间的关联度越大,PPI网络显示,共有168个节点,308条边,平均节点度为3.67,PPI富集p值<1.0e-16。共即筛选到开心散治疗AD的123个核心靶点,选择连接节点最多的前30,分别为AKT1,JUN,MAPK14,MAPK8,RXRA,RELA,EDN1,NR3C1,ESR1,TRAF2,CASP8,CTH,NOS2,NOS3,PRKCA,AR,CASP3,CHRM1,F2,IL1B,NFKBIA,STAT1,ARG1,ASS1,BCL2,CYP1A1,GOT1,NOS1,ADRA2A,ADRB2,利用R语言工具做成柱状图,如图4。
2.4 化合物-靶点-疾病网络构建
利用Cytoscape 3.7.1将药物与疾病交集基因导入以构建化合物-靶点-疾病网络,见图5。网络中共包括193个节点(163个核心靶点节点以及30个化合物节点)以及768条边,其中绿色方块节点代表化合物,粉色三角形节点代表靶点,每条边则是复方开心散的有效化合物分子与AD相关靶点之间的相互作用关系。网络中存在一个化合物与多个靶点的相互作用,同时也存在不同化合物相互作用于同一靶点,体现了开心散多成分、多靶点治疗AD的共同作用机制。
2.5 GO功能富集分析
对163个核心靶点进行GO功能富集分析,将p-Value<0.05和q-Value<0.05设定为基本筛选条件进行筛选,共得到GO条目个173个,选取最具有统计学意义的前20条结果做成柱状图和气泡图见图6,7。柱状图横坐标代表GO的基因名称,纵坐标代表富集在GO的基因数目,颜色代表q-Value,柱子长度代表基因的数目。气泡图横坐标代表GO的基因名称,纵坐标代表富集基因的比率,颜色代表q-Value,点的大小代表基因的数目。
 
GO功能富集结果显示开心散防治AD的GO功能富集与氨基酸结合,神经递质受体活性,神经递质结合,G蛋白偶联受体活性,氧化还原酶活性,类固醇激素受体活性,肽结合及辅酶结合等相关。
2.6 KEGG通路富集分析
对筛选出来的163核心靶点进行KEGG通路富集分析,将PValue<0.05和q-Value<0.05设定为基本筛选条件进行筛选,共得到KEGG条目135个,KEGG通路富集结果,见图8,图9。
 
如图8所示:纵坐标代表通路的名称,横坐标代表基因的数目,图中柱子的颜色代表富集的程度,越红富集程度越高,而柱子的长度代表在此通路上富集的基因数目,柱子越长代表富集的基因数目越多。
 
如图9所示:纵坐标代表通路的名称,横坐标代表富集基因的比率,图中点颜色代表富集的程度,越红富集程度越高,而点的大小的代表富集的基因数目,点越大代表位于该通路的基因数目越多。
 
KEGG通路富集结果显示开心散防治AD的KEGG通路富集与精氨酸生物合成(Arginine biosynthesis),流体剪切应力和动脉粥样硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis),钙信号通路(Calcium signaling pathway),肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway),Th17细胞分化(Th17 cell differentiation),IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway),C型凝集素受体信号通路(C-type lectin receptor signaling pathway),神经-配体-受体相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction),cAMP信号通路(cAMP signaling pathway),PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway),长时程增强(Long-term potentiation),p53信号通路(p53 signaling pathway)等通路密切相关。
图10是KEGG分析结果里得出q-Value值较高的流体剪切应力和动脉粥样硬化通路,根据图中右上方的标尺显示,颜色的深浅代表logFC绝对值大小,颜色越绿代表基因下调越明显,越红则代表基因上调越明显。
3 讨论
AD是一种痴呆症,是最常见的神经退行性疾病之一。我国老年痴呆的患病率为2%~5%,而且随着年龄的增长而逐渐上升。肝肾亏虚、痰浊阻窍,心神不安是引起谵妄、迟钝、健忘、抑郁的主要原因,中医以补虚、化痰、安神为主。开心散是《备急千金药方》中记载的益气养阴、安神健智、益智健脑的方剂[7]。现代研究表明,开心散具有明显的改善记忆衰退、安神益智、抗抑郁、抗衰老的作用,其主要活性成分包括人参皂苷和多糖类;茯苓多糖和茯苓酸;石菖蒲挥发油以及远志皂苷和寡糖类等[8]。该方中的各种中药对治疗AD患者和动物模型的学习记忆障碍有显著作用[9]。然而,其影响痴呆、健忘和其他中医脑病的确切分子机制仍不清楚。在高通量数据分析、计算机虚拟计算和网络数据库检索的基础上,以期能系统揭示开心散治疗AD的药理作用和分子机制[10]。本研究以网络药理学为基础,分析了开心散治疗AD的主要成分、关键靶点、基因功能和生物学过程,从而为开心散多成分、多靶点、多途径抗AD作用机制提供参考。
 
网络分析结果显示开心散中有效成分可能是通过AKT1,JUN,MAPK,NOS1,NOS2,NOS3,RELA,NFKBIA,BCL2,CASP3,CASP8,TRAF2,IL1B,NR3C1,ESR1等药物-疾病共有靶点网络起作用,包括了调节炎症的相关基因和细胞凋亡的相关基因。其中NOS1,NOS2,NOS3属于一氧化氮合成酶家族。最近的研究表明一氧化氮合成酶(NOS)系统的变化可能影响AD相关的发病机制。在中枢神经系统,神经元一氧化氮合成酶(nNOS)可介导突触传递的长时程调节(长时程增强,长时程抑制)、参与调节学习、记忆和神经发生等生理功能。而诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在神经炎症反应中起主要作用,它有助于从L-精氨酸中产生大量的一氧化氮(NO),在神经退行性病变过程中发挥着重要作用。较高水平的NO与活性氧(ROS)结合,导致过氧亚硝酸盐的形成。此外,硝基酪氨酸被认为是AD患者过氧亚硝酸盐和亚硝基应激的生物标记物。由NO激活的环氧合酶和其诱导亚型,均使AD患者脑细胞内的促炎因子上调,导致神经炎症[11,12]。此外,内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的异常可导血脑屏障功能障碍,这也被认为可能是AD发病的一个因素[13]。有报道称eNOS的缺乏会导致脑内的炎症反应,导致Aβ清除率的降低主要原因是由于激活脑内小胶质细胞而引发炎症反应。因此,eNOS缺乏可增加脑内的炎症因子,包括巨噬细胞炎性蛋白1β、IL-1α、CD6等[14]。
 
除此之外,结果中RELA,NFKBIA,BCL2,CASP3,CASP8是与细胞凋亡相关的基因。越来越多的证据表明,AD的发病机制与细胞凋亡有关[15],而神经炎症是神经细胞凋亡的重要标志。NF-κB信号通路的激活也发生在Aβ诱导的细胞凋亡中,活化的NF-κB进入细胞核,与特定基因的启动子区结合,启动转录,参与并调节凋亡相关基因的表达[16]。细胞凋亡是细胞死亡的一个活跃过程。细胞凋亡涉及两个途径:线粒体途径和膜受体途径。线粒体途径主要在细胞内和细胞外感知和传递环境信号,其中蛋白质家族起着重要作用。bcl-2家族蛋白参与细胞凋亡调控,这些蛋白质携带至少一个bcl-2同源结构域。当线粒体感应到死亡信号时,一系列bcl-2家族成员被用来通过caspase9激活caspase3来触发凋亡[17]。膜受体途径也称为死亡受体途径,细胞外死亡信号的主要感知和传递根据不同的死亡受体蛋白进行分类。死亡受体蛋白是由死亡信号触发的,当凋亡级联触发时,下游caspase3的触发是由caspase8触发的。然而Caspase家族也被称为死亡蛋白酶,是细胞凋亡的主要组成部分,一旦激活,就会引起细胞凋亡,并与许多其他细胞因子相互作用诱导细胞凋亡[18]。
 
KEGG富集分析发现NOS1、NOS2、NOS3、GOT2、GOT1、GPT2、GPT、ASS1、OTC、GLUL、ACY1等基因主要富集于精氨酸生物合成通路上,精氨酸是一氧化氮合酶的底物。据报道,L-精氨酸在大脑中与记忆形成有关区域中显著减少。精氨酸代谢途径主要通过NOS,产生气体信号分子NO,而eNOS生成的NO对维持正常脑血流量至关重要[19],并且先前的研究验证了AD脑中斑块、缠结的形成与毛细血管eNOS表达减少密切相关[20,21]。研究发现来自nNOS的NO在突触可塑性和学习记忆中起着重要作用,而来自iNOS的NO则起着促炎作用[22]。而神经炎症正是AD的一个潜在原因,或有助于疾病的进展,这种作用是通过NO介导的,NO信号通过nNOS参与记忆发育,通过iNOS介导中枢神经系统炎症过程的神经炎症反应[23]。它与中枢神经系统中的l-谷氨酸和NMDA受体直接相关,因此与长时程增强(LTP)也密切相关。LTP是学习记忆的重要过程。持续的LTP需要更高的突触强度,然后高频刺激突触中的神经递质。在记忆形成的过程中,它是通过突触强度的改变来编码的,LTP被认为是一种主要的细胞学习和记忆的机制,突触前终末重复刺激可使突触传递增强。因此,大量的Ca2+通过位于突触后膜上的NMDA受体表达,钙/钙调素介导的nNOS/NO调节显示了LTP的潜在诱导作用[24]。
 
此外,流体剪切力信号通路也需要我们特别关注,最近的研究发现流体剪切应力(FSS)在调节脑微血管内皮细胞的生理功能,影响血脑屏障的结构和功能,维持中枢神经系统的稳态中起着重要作用[25]。在KEGG结果中,有多达22个基因富集在该通路。
 
综上所述,网络理学预测结果表明,经典复方开心散治疗AD的可能机制:(1)参与细胞凋亡、氧化应激和炎症反应的调控;(2)通过NF-κB信号通路、精氨酸生物合成、流体剪切应力、IL-17信号通路以及长时程信号通路来干预AD病程的进展。本研究也揭示了开心散治疗AD的多成分、多靶点和多通路的协同作用的特点,为进一步深入研究开心散治疗AD药效物质和作用机制提供了重要的科学依据。本实验小组将在后续的研究中对预测的靶标基因和相关通路进行验证,深入探究中药经典复方开心散对于治疗AD的机制研究。
 
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