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基于网络药理学探讨鸦胆子对肺癌的作用机制

更新时间:2020-11-05 08:22点击:

摘    要:
目的:采用网络药理学方法探讨鸦胆子对肺癌的作用机制。方法:通过检索中药系统药理学数据库(TCMSP)提取鸦胆子的有效成分及其相关作用靶点;检索GeneCards和OMIM数据库提取肺癌疾病靶点;采用STRING数据库构建蛋白互作网络,Cytoscape构建化合物-靶点网络以及化合物-靶点-生物过程-通路网络,DAVID数据库对靶点进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。结果:检索TCMSP得到并通过OB值和DL值筛选得到有效成分15中,有效靶点44个。检索GeneCards数据库和OMIM数据库得到疾病靶点21 729个,将化合物靶点与疾病靶点相映射得到交集靶点39个。将结果导入Cytoscape软件,构建“化合物-靶点”网络;再构建“药物-化合物-靶点-疾病”网络。将关键靶点导入STRING数据库,构建蛋白互作网络,其中度值较高且处于较核心位置的靶点有CASP3、CCND1、EGFR、IL6、AR等。再对39个关键靶点进行富集分析,结果显示鸦胆子治疗肺癌的关键靶点共富集为7个生物过程聚类,涉及58个条目,经过筛选剩余9个生物过程。对鸦胆子治疗肺癌的39个关键靶点进行通路富集,结果显示共有7个富集的通路聚类,涉及62个条目,经过筛选剩余12条通路。结论:鸦胆子治疗肺癌的临床疗效确切,基于数据库的机制分析也证实它不仅可以治疗小细胞肺癌,同时也可以作用于非小细胞肺癌。
 
关键词:
鸦胆子; 肺癌; 网络药理学; 中医; 作用机制;
肺癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤,是全球癌症相关死亡的主要原因之一,死亡人数居癌症死亡人数之首[1]。据估计,2012年新增病例180万例,死亡人数160万[2]。吸烟是导致肺癌最重要的危险因素,其他危险因素包括二手烟、职业暴露以及其他有害物质暴露。一般来说,肺癌在组织学上可分为2类,即小细胞肺癌与非小细胞肺癌。肺癌的治疗主要是通过手术治疗、放疗和化疗达到治愈或控制病情的目的。但是放射治疗仍有部分患者表现出放疗抵抗,或在化疗过程中表现为化疗耐药。而且大多数新病例是60岁甚至70岁以上的老年人,他们多半有其他疾病、或者体质虚弱不能耐受放化疗,以及部分晚期恶病质患者KPS评分和ECOG评分较低,综合评估后不适合放化疗的患者常常会选择姑息治疗[3]。中药治疗就成为姑息治疗患者的首选,目前临床中最常用的抗肿瘤药物就是鸦胆子,中成药为鸦胆子油注射液、鸦胆子油口服乳液以及鸦胆子油软胶囊等多种剂型。鸦胆子味苦性寒,有小毒,属于清热解毒药,具有清热解毒、截疟止痢等功效。鸦胆子作为一种广谱的抗癌药,对肺癌、胃癌、乳腺癌以及结直肠癌等多种肿瘤均表现出良好的疗效,但是本研究主要基于网络药理学探讨鸦胆子对肺癌的作用机制。网络药理学是一种基于数据挖掘研究中药有效成分及其对疾病作用靶点的新方法,可以科学全面的分析药物作用靶点及其可能的作用通路,为临床使用鸦胆子治疗肺癌提供理论依据,并为基础科研提供参考。现报道如下。
 
1 资料与方法
1.1 数据库及软件
中药系统药理学数据库(TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php);Uniprot数据库(http://www.uniprot.org);OMIM数据库(https://omim.org/)和GeneCards数据库(https://www.genecards.org/);STRING数据库(https://string-db.org/);DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)以及软件Cytoscape 3.6.0和Rx64 3.5.3。
 
1.2 收集鸦胆子的有效成分
TCMSP是中药网络药理学常用的数据库之一,共收录499种中药的有效成分及相关靶点,并提供10个指标对化合物进行筛选,本研究选择最常用的指标DL(类药性)和OB(口服生物利用度)。在“Herbname”中以“鸦胆子(yadanzi)”作为检索词,点击“Ingredients”收集目前已经证实的化合物。然后将OB值限定为大于30%及DL值限定为大于0.18,筛选口服生物利用度高并且药物相似性较好的化合物。
 
1.3 预测鸦胆子作用靶点
在TCMSP数据库收集的化合物界面点击“Related Targets”即可得到鸦胆子化合物作用的相关靶点,然后将其输入Uniprot数据库,将药物的靶蛋白名称转换为基因名。
 
1.4 收集疾病相关基因
GeneCards数据库和OMIM数据库是2个疾病基因数据分析平台,首先将“lung cancer”作为关键词检索GeneCards数据库,然后打开OMIM数据库,找到Gene Map界面,以“lung cancer”作为检索词,然后将上述2个数据库检索得到的结果进行汇总并采用R VennDiagram程序包对药物靶点和疾病靶点取交集,再对得到的鸦胆子治疗肺癌的交集靶点(关键靶点)进行分析。
 
1.5 构建化合物-靶点网络及化合物-靶点-疾病-靶点网络
采用Cytoscape软件构建化合物-靶点网络,并通过Layout选项调整图形,在style选项中调整化合物及基因的形状和颜色。其中节点分别代表鸦胆子的化合物及其靶点;边分别药物有效成分与疾病靶点相互作用关系。将药物以及得到的化合物、核心靶点导入Cytoscape软件,构建药物-化合物-疾病-靶点网络,然后调整图形并修改形状和颜色。其中节点分别代表鸦胆子的药物、化合物、疾病和靶点;边分别药物各成分之间的关系。
 
1.6 构建PPI网络
将上述鸦胆子关键靶点导入STRING数据库,物种类型选择人,设置将网络图中边的含义选择为线颜色表示交互证据的类型,可信程度设定为中等(0.7),显示设定为隐藏图中离散的点,即可得到PPI网络图。然后导出结果,并采用R barplot程序包绘制前靶点的柱状图。
 
1.7 GO富集与KEGG富集分析
DAVID数据库是较为全面的生物功能注释信息平台,将上述关键靶点输入DAVID,数据类型选择“OFFICIAL GENE SYMBOL”,表格类型选择“gene list”,物种类型选择为“Homo sapiens”,背景选择“Homo sapiens”,再选择“Functional Annotation Tool”即可选择进行GO富集分析和KEGG富集分析。进行GO富集生物过程以及KEGG富集信号通路的筛选时限定条件为P<0.05、FDR<0.1以及所研究疾病的相关性,若所得结果仍较多,则根据所富集基因数目选取前20位。最后将化合物、靶点及通路信息采用Cytoscape软件构建“化合物-靶点-生物过程-通路”网络。
 
2 结果
2.1 鸦胆子有效成分筛选
检索TCMSP得到鸦胆子有效成分28种,通过OB值和DL值筛选得到有效成分7中。见表1。
 
2.2 鸦胆子有效成分相关靶点
检索TCMSP得到鸦胆子相关靶点158个,筛选得到有效靶点44个。其中beta-sitosterol相关作用靶点16个,luteolin相关作用靶点28个,删除重复和无效靶点,最终得到鸦胆子化合物靶点40个。见表2。
2.3 肺癌相关基因
检索GeneCards数据库和OMIM数据库得到疾病靶点21 729个。将上述所得鸦胆子化合物靶点与疾病靶点相映射共得到交集靶点39个,认为它们是鸦胆子治疗肺癌的“关键靶点”。见图1。
2.4 “化合物-靶点”网络图
将鸦胆子化合物与关键靶点导入Cytoscape软件,构建“化合物-靶点”网络。图2中绿色代表鸦胆子化合物,黄色代表关键靶点。然后将药物、化合物、关键靶点和疾病导入Cytoscape软件,构建“药物-化合物-靶点-疾病”网络。图3中,红色部分代表疾病,蓝色部分代表药物,绿色部分代表化合物,黄色部分代表关键靶点。
 
2.5 构建的PPI网络图
为了直观的了解鸦胆子作用于肺癌的情况,将关键靶点导入STRING数据库,构建蛋白互作网络(PPI网络),网络中共有39个节点,108条边,其中度值较高的靶点处于较核心位置,如CASP3、CCND1、EGFR、IL6、AR等。并将PPI网络结果导出,采用R软件展示PPI网络中前20位的靶点。见图4、图5。
2.6 GO富集与KEGG富集分析
对39个关键靶点进行富集分析,结果显示鸦胆子治疗肺癌的关键靶点共富集为7个生物过程聚类,涉及58个条目,经过筛选剩余9个条目。见表3。对鸦胆子治疗肺癌的39个关键靶点进行通路富集,结果显示共有7个富集的通路聚类,涉及62个条目,经过筛选后剩余12条通路。见表4。最后将化合物、靶点、GO富集和KEGG富集结果汇总,构建“化合物-靶点-GO富集-KEGG富集”网络。见图6。
 
3 讨论
肺癌属于中医“内科癌病、肺积”的范畴,其发病是内外因共同作用的结果。内因不外脏腑气血阴阳亏虚、情志劳倦以及体质因素等,外因包括六淫邪气、外界毒物、饮食不节等。上述内外因作用损伤肺脏的生理功能,肺之宣降功能失司,肺气不降则脾气不升,气不能循环周流,郁滞于胸中,气滞则痰湿瘀毒凝聚不散,日久形成积块。早期以邪实为主,治疗主要攻邪;中期以虚实夹杂为主,治以攻补兼施;晚期肺癌以正虚为主,治疗主要为扶正兼以攻邪。众多文献报道中医药治疗能够减轻化疗、放疗及靶向治疗的不良反应,并且相关研究表明中医药治疗可能在化疗药物及靶向药物耐药机制方面发挥一定作用[4]。也有许多临床研究表明单纯或者联合中医药治疗肺癌可以使患者带瘤生存,提高生命质量,延长生存时间[5]。在实际生活中也有中晚期肺癌的患者在单纯中医治疗下取得良好疗效的案例,因此中医药治疗在肺癌的治疗中仍显得非常重要。临床中医治疗肺癌常用的中药单体注射剂有鸦胆子油注射液、康莱特注射液、斑蝥注射液以及榄香烯注射液等,临床疗效均较为可靠,本文主要就鸦胆子油注射液进行探讨。
 
鸦胆子归大肠,肝经,有小毒,目前报道的不良反应主要有胃肠道反应以及肝肾功能损害。《素问·六元正纪大论》指出“有故无殒,亦无殒也”。虽然鸦胆子有小毒,但是对于患有疾病的人群而言这种毒性也可能是发挥治疗作用的有效成分,本研究最终得出的β-谷甾醇和木犀草素这二种作用于肺癌靶点的有效成分,而其他口服利用度、药物相似性高的有效成分可能成为也会增加不良反应。文献报道β-谷甾醇对肺癌、肝癌、乳腺癌以及结直肠癌等多种癌症细胞的生长具有抑制作用[6],周玲玉等[7]研究发现β-谷甾醇不仅能够阻断肿瘤细胞的繁殖周期,而且能够诱导肿瘤细胞的凋亡,并且这种作用随着药物剂量的增加细胞凋亡的发生率也增加,表明β-谷甾醇具有一定的抗肿瘤作用。木犀草素具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等多种作用[8],缪存静等[9,10]研究认为木犀草素能够逆转肺癌细胞的上皮间充质转化,从而降低肿瘤细胞的侵袭率,抑制肿瘤细胞转移并促进细胞分化。
 
关键靶点中度值较高的基因为CASP3、CCND1、EGFR、IL6、AR,他们可能是鸦胆子发挥治疗效应的关键。其中CASP3[11]是发挥细胞凋亡作用的主要执行者,它通过促进肿瘤细胞凋亡发挥抑制肿瘤生长;CCND1[12]可以促进肿瘤细胞凋亡、抑制细胞迁移和入侵;EGFR[13]在肺癌的发生、发展中扮演着重要角色,它参与肺癌的增殖凋亡,并且可以影响放化疗的敏感性,EGFR的高表达可以促进肿瘤细胞凋亡,抑制其增殖;IL6[14]虽然是重要的炎性反应因子,但是对肺癌的发病也发挥着重要作用,它可以与肿瘤细胞表面的受体结合,促进中路微血管形成;AR[15]是一种重要的转录因子,参与细胞凋亡和血管生成。
 
GO富集分析所得药物结合、半胱氨酸型内肽酶活性参与细胞凋亡过程、凋亡过程、RNA聚合酶II启动子转录的正调控、ERK1和ERK2级联的正调控等生物过程与肺癌密切相关。KEGG富集分析所得前列腺癌、细胞凋亡、胰腺癌、膀胱癌、HIF-1信号通路[16]、非小细胞肺癌、癌症miRNA、TNF信号通路[17]、p53信号通路[18]、小细胞肺癌等通路在肺癌相关机制中也扮演着重要角色。上述生物过程及通路与肿瘤细胞的转移、凋亡以及血管生成联系密切,与关键靶点相一致。
 
综上所述,基于网络药理学方法的分析方法认为鸦胆子治疗肺癌有一定的理论依据,为进一步研究明确鸦胆子治疗肺癌的机制研究提供了参考。
 
参考文献
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