27医学论文范文网

主页
分享医学论文范文

抗纤丸治疗肝纤维化的网络药理学研究

更新时间:2020-11-16 08:56点击:

摘    要:
目的:通过网络药理学方法,构建抗纤丸中药-成分-靶点网络及蛋白互作网络,初步探索抗纤丸治疗肝纤维化的机制和功能。方法:通过Batman-TCM数据库挖掘抗纤丸化学成分和潜在靶点,使用OMIM和Drugbank数据库获取肝纤维化相关靶点,得到抗纤丸治疗肝纤维化的化合物和作用靶点。利用STRING数据库构建蛋白质相互作用网络,筛选关键作用靶点,采用Cytoscape软件绘制中药-成分-靶点网络。使用Metascape平台寻找关键作用靶点富集的通路和功能。并将相关作用靶点导入BioGPS和Genecards数据库中获得组织分布和亚细胞分布。结果:筛选抗纤丸作用化合物213个,关键作用靶点55个,靶点相关的通路20条,作用途径涉及氧化应激、肝脏炎症反应和脂质代谢。结论:抗纤丸可能通过调控氧化应激、肝脏炎症反应和脂质代谢,发挥治疗肝纤维化的作用。
 
关键词:
抗纤丸 肝纤维化 网络药理学 氧化应激 炎症反应 脂质代谢
抗纤丸是天津市第二人民医院院内制剂,由血府逐瘀汤加减化裁而来,具有活血化瘀和扶正祛邪之功,临床用于治疗慢性活动性肝炎、肝纤维化及肝硬化已近50年。自上世纪90年代开始,课题组经过多年的药理和临床研究证实[1,2],抗纤丸具有减轻肝细胞炎症反应、调节相关细胞因子、降解各型胶原基质等多种抗肝纤维化的作用,药用价值和安全性较为肯定。
 
肝纤维化是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生,导致肝脏中细胞外基质的过度积累,纤维性瘢痕形成的病理过程。早期肝纤维化经过及时干预治疗,可减缓或防止进展为肝硬化甚至肝癌[3]。目前大量研究表明:相较于化学药物,中药具有多靶点、多途径、多层次的药理作用优势,能够整体系统地抑制肝纤维化的进展[4]。中药复方抗纤丸成分复杂,针对其治疗肝纤维化的活性成分、作用靶点和作用途径仍不明确,尚待深入。网络药理学基于网络生物学和多向药理学,尤其适合揭示中医药的复杂作用机制。本研究通过网络药理学方法,初步探索和阐述抗纤丸治疗肝纤维化的药理学机制,为其在临床的使用提供理论依据,为进一步的药物研发提供思路。
 
1 材料与方法
1.1 网站数据库和分析软件
中药分子作用机制网络分析工具(Batman-TCM)(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)数据库;OMIM疾病数据库(http://www.omim.org);Drugbank数据库(https://www.Drugbank.ca/);Uniport数据库(https://www.uniprot.org/);STRING数据库(https://string-db.org);网络图像可视化软件Cytosca pe3.4.0软件(https://cytoscape.org/);Metascape网络分析平台(metascape.org/gp/index);Bio GPS数据库(http://biogps.org/);Genecards数据库(https://www.genecards.org/)。
 
1.2 方法
1.2.1 抗纤丸化学成分与靶点挖掘
通过BatmanTCM数据库挖掘抗纤丸(当归、川芎、赤芍、鳖甲、川楝子、黄芩、太子参、白花蛇舌草、黄芪、五味子、冬虫夏草和甘草)单味中药的化学成分。设置化合物靶点预测的阈值(score cutoff>20)筛选抗纤丸单味药的潜在蛋白靶点。
 
1.2.2 肝纤维化相关靶点获取
以“hepatic fibrosis”和“liver fibrosis”为检索词,分别通过OMIM和Drugbank数据库获取肝纤维化相关靶点。使用Uniport数据库,限定物种为人,对蛋白进行名称规范转化操作。
 
1.2.3 蛋白质相互作用网络的构建及关键靶点筛选
将“1.2.1”和“1.2.2”项中得到的靶点进行比对,筛选重复靶点,并导入STRING数据库,选择物种为“Homo sapiens”,构建蛋白相互作用网络。选取分值>0.9分的高置信度区间,并根据自由度值(一个节点在蛋白互作网络中与该点直接作用的节点的数目,自由度越大则其参与的生物功能越多)筛选关键靶点。
 
1.2.4 抗纤丸中药-成分-疾病靶点网络构建
将抗纤丸单味药、化合物成分、关键作用靶点信息导入Cytoscape 3.4.0软件绘制中药-成分、成分-疾病靶点网络图。采用Merge功能最终建立中药-成分-疾病靶点网络。
 
1.2.5 基因功能与通路分析
为进一步研究抗纤丸治疗肝纤维化的作用情况,使用Metascape平台对肝纤维化和抗纤丸相关靶点进行总体分析。将抗纤丸治疗肝纤维化的关键作用靶点,进行KEGG代谢通路富集分析和GO生物过程富集分析。同时将关键作用靶点分别导入Bio GPS和Genecards数据库中获得组织分布和亚细胞分布相关信息,并作网络构建。
 
2 结果
2.1 抗纤丸作用化合物及靶点
检索数据库得到抗纤丸化合物及相关靶点数,见表1。删除重复数据,获得抗纤丸作用化合物共577个,涉及相关作用靶点1 788个。
 
2.2 肝纤维化相关靶点
在OMIM和Drugbank数据库中分别找到肝纤维化相关靶点536和297个,去除重复基因,共得到632个疾病靶点。
 
2.3 蛋白质相互作用网络的构建及关键靶点筛选
将抗纤丸作用靶点与肝纤维化靶点进行比较,查找抗纤丸治疗疾病的作用靶点共计194个。为筛选出关键作用靶点,将194个蛋白导入SERING平台进行蛋白互作网络可视化,见图1。根据自由度筛选得到55个关键作用靶点,见表2。
2.4 构建抗纤丸中药-成分-疾病靶点网络
将抗纤丸12味中药、涉及的213个化合物成分和55个关键靶点信息导入Cytoscape软件绘制中药-成分、成分-疾病靶点网络图。采用Merge功能合并网络,对单味中药、成分和靶点进行标识。如图2所示,共涉及280个节点和564条边。节点表示单味中药、成分和疾病靶点,边表示三者彼此间的关联。其中六边形节点表示单味中药,三角形节点表示化合物成分,圆形节点表示关键靶点。
2.5 基因功能与通路分析
将1 788个抗纤丸治疗相关靶点和632个肝纤维化相关靶点分别导入Metascape平台,使用最新版本数据库(最后更新时间为2019-09-14)转化为相应的H.sapiens种类的基因。外圈大半圆为抗纤丸治疗相关靶点,外圈小半圆为肝纤维化靶点。内圈用深色的连线将两者重叠的基因进行连接,并用内圈深色部分标识,浅色曲线连接属于同一丰富本体术语的基因,见图3。使用KEGG pathway、GO Biological Processes、Reactome gene Sets、Canonical Pathways、CORUM对55个关键作用靶点进行通路富集分析。对排名前20名的通路途径进行展示,“靶点数”表示提供的列表中具有参与特定通路的基因数量;P值由累积超几何分布计算而得,P值越小,表示这个通路中富集的差异基因越多,“Log10(P)”是log以10为底的值。“Log10(q)”是log以10为底的多测试调整后的P值,结果见表3。结果显示:抗纤丸治疗肝纤维化可能与活性氧代谢过程调控、炎症反应调控、转移酶活性正调控、脂质代谢过程调控、平滑肌细胞增殖的调控和胶质细胞再生等密切相关。
2.6 关键作用靶点组织分布和亚细胞分布
将55个抗纤丸治疗肝纤维化的关键作用靶点导入Bio GPS数据库,获得其组织分布信息。为保证结果的可靠性,值保留每个基因表达量较高的前5位组织,将组织分布信息导入Cytoscape软件构建组织-靶点网络,结果见图4-A。其中菱形节点表示组织,节点表示度值大小,V型节点表示靶点。结果显示,关键作用靶点主要分布于肝脏(liver,度值=33)、心肌细胞(cardiac myocytes,度值=18)、心脏(heart,度值=16)、全血(whole blood,度值=13)、CD56+自然杀伤细胞和胚胎肝(CD56+NK cells、fetal liver,度值=12)、CD33+髓细胞、CD14+单核细胞、平滑肌、CD34+细胞(CD33+myeloid、CD14+monocytes、smooth muscle、CD34+,度值=10)、脂肪组织(adipocyte,度值=8)。此外,众多免疫细胞和免疫器官如:BDCA4+树突细胞、CD8+T细胞、721 B淋巴细胞和CD19+B细胞也在治疗中发挥一定作用。这些结果能够为抗纤丸治疗作用的药理学分子研究提供指导。将上述55个关键作用靶点导入Genecards数据库,获取和保留confidence大于5的各靶点亚细胞分布信息。采用Cytoscape软件构建亚细胞-靶点网络,结果见图4-B。其中圆形节点代表靶点,三角形节点代表亚细胞结构。结果显示,靶点更多分布于细胞膜(plasma membrane,度值=29)、细胞外基质(extracellular,度值=27)、细胞核(nucleus,度值=20)、细胞基质(cytosol,度值=15)。此外,结果也提示高尔基体、内质网、核内体、细胞骨架、线粒体以及溶酶体可能为药物作用的重要细胞结构。
3 讨论
中医学无肝纤维化病名记载,根据其病理变化和临床表现,可归属于“胁痛”、“积聚”范畴。基本病机为正虚邪盛,邪毒久积,气滞血瘀,肝络受损,依据病患体质可出现不同临床表现。肝纤维化本质是“虚损生积”,肝脏性质损伤,阴精亏损,无以化气,导致气血不行,血凝成积[5,6]。根据中医传统理论,抗纤丸方中当归、川芎、赤芍活血化瘀,鳖甲滋阴软坚共为君;黄芪扶正益气,冬虫夏草益肺肾补精髓,五味子收敛固涩益气生津,太子参健脾生津四者共为臣;川楝子疏肝通络为佐;黄芩、白花蛇舌草清热解毒,甘草调和诸药为使;十二味中药调理肝脾肾三脏,活血化瘀,软坚散结以达益气扶正祛邪之功效。
 
活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)是生成纤维组织的关键细胞,在肝纤维化的发生发展中起关键作用。不同病因刺激造成肝脏慢性损伤,肝细胞凋亡、坏死或坏死性凋亡,导致肝脏炎症。肝细胞、肝窦内皮细胞、Kupffer细胞和淋巴细胞可通过释放细胞内容物、细胞因子和活性氧簇等,刺激静止的肝星状细胞活化,导致肝脏细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的过度增生与沉积,形成肝窦和纤维间隔的毛细血管化,并伴有间隔内的血管增生,最终发生肝纤维化[7]。目前治疗肝纤维化的主要策略主要有:治疗原发病、改善肝实质细胞损伤与凋亡、调节ECM合成与降解、干细胞移植和基因治疗等[8]。
 
网络分析显示:抗纤丸可能通过调控氧化应激(GO:2000377)、肝脏炎症反应(GO:0040017、GO:0050900、GO:0050727、GO:0001816、GO:0045785)、脂质代谢(GO:0062012、GO:0019216、GO:1905952、GO:0048660、GO:0042063)发挥治疗肝纤维化的作用。临床和实验研究表明[3],氧化应激通过产生活性氧ROS介导纤维化进展。DNA、蛋白质和脂质氧化破坏诱导肝细胞坏死及凋亡,放大炎症反应,促使纤维化发生。肝脏的慢性炎症包括:白细胞的浸润和巨噬细胞的活化等,诱导肝细胞的坏死和凋亡,坏死的肝细胞刺激Kupffer细胞分泌炎症介质,直接启动HSC的激活[9]。而HSC的激活又可促进自然杀伤细胞、T细胞、树突细胞、巨噬细胞和内皮细胞的表达,形成炎症和纤维化之间的恶性循环,促进纤维化进展[10]。川芎的主要活性成分川芎嗪可抑制HSC增殖,促进其凋亡,通过参与Hedgehog通路发挥抗纤维化作用[11]。此外川芎嗪还可通过NLRP3炎症小体途径减轻炎症,抑制HSC中炎症细胞因子表达[12,13]。鳖甲提取物可通过TGF-β1/Smad NF-κB信号通路抑制HSC激活[14]。
 
脂肪细胞因子由脂肪组织分泌,其中瘦素是循环脂肪形成激素,具有促进纤维发生的作用。而脂联素作为血浆中最丰富的脂肪因子,其表达与AMPK和PPARγ调控有关,对肝脏具有一定的保护作用[3]。五味子提取物联苯双酯可调控HSC中PPARγ表达,抑制细胞增殖,促进其凋亡[15]。脂联素可促进基质金属蛋白酶的活化,进而发挥抗纤维化的作用。当归、川芎等药材的水溶性提取物阿魏酸钠可通过调控基质金属蛋白酶,抑制胶原分泌,控制肝纤维化发展[16]。
 
中药黄芩中的黄酮类化合物黄芩苷可抑制脂类代谢、炎症和纤维化的关键调节因子,发挥抗纤维化的作用[17]。
 
抗纤丸治疗的关键组织靶点多分布于肝脏(胚胎肝)、心脏(心肌细胞)、血液、平滑肌、脂肪组织以及相关免疫细胞,包括CD56+自然杀伤细胞、CD33+髓细胞、CD14+单核细胞、CD34+细胞、BDCA4+树突细胞、CD8+T细胞、721 B淋巴细胞和CD19+B细胞等。这些结果与抗纤丸可能发挥抗炎、改善血液循环、抗氧化、调节脂质代谢等生物学功能的基础相符。亚细胞分布研究表明55个关键作用靶点倾向分布于细胞膜上,其中高尔基体、内质网、核内体、细胞骨架、线粒体以及溶酶体可能为药物作用的重要细胞结构。这些组织分布和亚细胞结构的梳理研究,为抗纤丸治疗肝纤维化的药理学分子研究提供指导。
 
综上所述,本研究采用网络药理学方法揭示抗纤丸治疗肝纤维化的多靶点、多通路的复杂机制。结果显示抗纤丸可能通过调控氧化应激、肝脏炎症反应和脂质代谢,发挥重要的治疗作用。拓宽了抗纤丸在治疗肝纤维化方面的视角,也为中药复方治疗肝纤维化提供了机制研究方面的思路。
 
参考文献
[1]魏智勇,郑淑文.中药制剂抗纤丸中药成分的药理作用[J].天津药学,2005,17(6):64-66.
 
[2] 魏智勇,王俊华,边景,等.抗纤丸的薄层色谱鉴别[J].中国医院药学杂志,2007,27(11):1625-1626.
 
[3] 吕超,毛德文,石清兰,等.中药及其复方抗肝纤维化作用机制的研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2020,26(4):242-250.
 
[4] 张美军,杨胜辉.中医药治疗肝纤维化研究进展[J].湖南中医杂志,2019,35(10):173-176.
 
[5] 谭春雨,刘平.肝硬化“虚损生积”病机理论溯源及其临床意义[J].上海中医药大学学报,2010,24(4):25-28.
 
[6] 慕永平,刘成海,张华,等.肝硬化“虚损生积”论———刘平教授学术思想浅析[J].上海中医药大学学报,2013,27(2):1-4.
 
[7] 徐列明,刘平,沈锡中,等.肝纤维化中西医结合诊疗指南(2019年版)[J].中国中西医结合杂志,2019,39(11):1286-1295.
 
[8] 方未英,徐兰,顾婷玉,等.肝纤维化治疗策略的研究进展[J].医学研究杂志,2019,48(4):6-9.
 
[9] Czaja A J. Hepatic inflammation and progressive liver fibrosis in chronic liver disease[J]. World journal of gastroenterology:WJG,2014,20(10):2515.
 
[10] Lee U E,Friedman S L. Mechanisms of hepatic fibrogenesis[J]. Best practice&research Clinical gastroenterology,2011,25(2):195-206.
 
[11] Jue H,Gang C,Xin W,et al. Tetramethylpyrazine inhibits activation of hepatic stellate cells through hedgehog signaling pathways in vitro[J].BioMed Research International,2015(13):1-5.
 
[12] 陈巧霞,付金柏,姚真,等.川芎嗪对肝星状细胞的增殖及凋亡的影响[J].中药药理与临床,2018,34(1):48-53.
 
[13] Wu X,Zhang F,Xiong X,et al. Tetramethylpyrazine reduces inflammation in liver fibrosis and inhibits inflammatory cytokine expression in hepatic stellate cells by modulating NLRP 3 inflammasome pathway[J].IUBMB life,2015,67(4):312-321.
 
[14] Hu Z,You P,Xiong S,et al. Carapax Trionycis extracts inhibit fibrogenesis of activated hepatic stellate cells via TGF-β1/Smad and NFκB signaling[J]. Biomedicine&Pharmacotherapy,2017,95:11-17.
 
[15] 魏丹芸,张洪,张英,等.联苯双酯对大鼠肝星状细胞增殖和凋亡及PPARγ表达的影响[J].中国药师,2016,19(3):413-416.
 
[16] 张志毕,蔡婷,缪紫娥,等.阿魏酸钠对乙醛诱导的肝星状细胞增殖、活化和胶原合成的影响[J].中国实验方剂学杂志,2018,24(12):123-128.
 
[17] 程金秋,李霞,王晓勇.中医药治疗肝纤维化作用机制研究进展[J].亚太传统医药,2019,15(10):182-185.

推荐文章

在线客服系统