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基于网络药理学探讨越鞠丸快速抗抑郁作用机制

更新时间:2020-12-04 08:14点击:

  摘    要:
  
  目的 基于计算机技术预测越鞠丸快速抗抑郁的主要活性成分及作用靶点,探讨其抗抑郁的作用机制。方法 借助中药系统药理学分析平台(TCMSP)检索越鞠丸的化学成分和作用靶点,通过GAD、TTD、PharmGkb多个数据库查询与抑郁相关的基因。采用UniProt数据库查询靶点对应的基因,进而运用Cytoscape 3.2.1构建化合物-靶点(基因)网络、蛋白相互作用(PPI)网络筛选出核心靶点,最后通过DAVID进行基因本体(GO)功能富集分析和基于京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,研究其作用机制。结果 从越鞠丸中筛选出了39个化合物157个相应蛋白靶点,PPI网络筛选出了核心靶点20个。39个活性成分主要通过ESR1、AR、GSK3B和CYP3A4等20个靶点通过参与突触传递负调节、多巴胺分解转运、基因表达、信号转导、记忆、药物反应、对雌二醇的反应和磷脂酶C激活G蛋白偶联受体及5-羟色胺受体的信号传导,主要涉及了含血清素的神经突触通路、多巴胺能神经突触通路、药物代谢-细胞色素P450通路、催乳激素信号通路、甲状腺激素信号通路等16条通路。结论 越鞠丸是多成分、多靶点、整体调节快速抗抑郁,探讨了越鞠丸抗抑郁的潜在机制,为其活性成分研究和进一步实验研究提供理论依据。
  
  关键词:
  
  越鞠丸 网络药理学 成分-靶点网络 抑郁症 通路分析
  
  抑郁症是以显著而持久的心境低落为主要特征的一类心境障碍,是最常见的精神障碍之一,严重影响患者的学习、生活和社会功能,如不能得到及时、有效、规范化的治疗,将会导致巨大的心理及经济负担[1]。目前临床上广泛使用针对单胺类递质失衡的选择性五羟色胺再摄取抑制剂,但有效率仅为50%,并且存在临床症状改善缓慢、不良反应多、药价高、易复发等缺陷[2],现阶段如何提高临床治愈率是治疗抑郁症的重要问题。
  
  实验研究发现越鞠丸有快速而持久的抗抑郁作用[3-4],但由于中药复方有着多成分-多靶点-多效应、协同作用强、整体调节等特点,其具体的作用机制尚不明确。本次研究我们借助网络药理学从多靶点的角度将药物靶点网络与生物信息网络相结合,基于越鞠丸治疗抑郁症的作用靶点、代谢物、通路等方面进行了探索,揭示其快速抗抑郁的分子机制,为探索中药复方的复杂机制和新药研发提供新的思路。
  
  1 资料与方法
  
  1.1 越鞠丸的成分收集
  
  本次研究依托中药系统药理学技术平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology,TCMSP)[5]检索苍术、香附、川芎、栀子的全部化学成分。因六神曲由苦杏仁、赤小豆、青蒿、苍耳草、辣蓼和面粉(或麦麸)按照一定比例混合后发酵制成,因此其药效并非基于“成分-靶标”的原则来发挥,而是可能通过调节肠道菌群来发挥作用,故暂时无法基于整合药理学平台进行分析。
  
  1.2 活性化合物及靶标蛋白的筛选
  
  中药饮片须通过吸收、分布、代谢、排泄(ADME)过程达到靶点器官、组织发挥作用。选择吸收、分布、代谢和排泄方面的药物相似度(DL)和口服生物利用度(OB)作为筛选标准,选择同时满足OB≥30%和DL≥0.18条件的生物活性成分进行进一步分析。从TCMSP数据库收集到与所选生物活性化合物相关的靶点,并使用UniProt数据库[6](Universal Protein)(http://www.uniprot.org)确认预测的目标信息,包括名称和基因ID,选择人类的靶点蛋白。
  
  1.3 疾病靶点的筛选
  
  通过GAD(Genetic Association Database)(https://geneticassociationdb.nih.gov/),其中,GAD已下线,不过可以在网站上下载、TTD(Therapeutic Target Database)(http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp)和PharmGkb数据库(Pharmacogenomics Knowledgebase)(https://geneticassociationdb.nih.gov/)[7],以depression、depressive、depressed和antidepressant关键词搜索已报道的和抑郁症相关的基因,去除重复的基因,利用UniProt对获得的疾病相关靶标信息(包括靶标名称和基因ID)进行了验证,最后与越鞠丸的基因靶点匹配,得到越鞠丸活性成分的抗抑郁潜在靶点。
  
  1.4 越鞠丸化合物-靶点网络的构建
  
  为了在系统水平上了解这些化合物与相应目标之间的复杂相互作用,我们在越鞠丸候选化合物及其潜在靶点的基础上,利用Cytoscape 3.2.1软件构建了化合物-靶点网络[8]。
  
  1.5 蛋白质相互作用网络(PPI)的构建及其核心网络的筛选
  
  通过Venny 2.1软件将疾病靶点与药物成分靶点进行Venn分析,重叠越鞠丸的潜在靶点和选定的抑郁靶点,进一步阐明越鞠丸在抑郁症治疗中的潜在机制。利用获得的与抑郁相关的共同靶标和越鞠丸潜在靶标,将蛋白种类设置为“Homo sapiens”,构建了基于STRING数据库的蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络[9]。并利用Cytoscape 3.2.1平台对互联网络进行可视化分析,并进行插件网络分析,分析网络拓扑特性。
  
  1.6 核心靶点的通路分析
  
  为了深入了解各种生物过程和分子功能所涉及的假定靶标的作用,本研究将抗抑郁治疗靶点导入DAVID[10]数据库(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)进行GO(gene ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析,选择对应的物种“Homo Sapiens”,阈值为P<0.05,并通过Omicshare(http://www.omicshare.com/tools/index.php/)对富集分析结果进行可视化处理。
  
  2 结果
  
  2.1 活性化合物的筛选
  
  通过TCMSP检索到苍术49个、香附104个、川芎189个、栀子19个化合物信息,根据设置的筛选条件(OB≥30%,DL≥0.18),其中苍术9个、香附18个、川芎7个、栀子5个,39个化合物基本信息见表1。
  
  2.2 化合物-靶点相互作用网络
  
  化合物-靶点网络总共包括194个节点(31个化合物节点、157个靶点节点,其中7个化合物没有对应的靶点)和730条边,其中蓝色节点代表苍术的化合物分子,橘色代表香附的化合物分子,黄色代表川芎的化合物分子,黄绿色代表栀子的化合物分子,金黄色节点代表药物靶点,每条边则表示化合物分子与靶点之间的相互作用关系(图1),31个化合物中有7个化合物未参与网络构建。
  
  2.3 越鞠丸与抑郁症的交集基因
  
  通过数据库找出越鞠丸中苍术共51个作用靶点,香附147个作用靶点,川芎31个作用靶点,栀子93个作用靶点,抑郁175个相关基因。通过在线韦恩图得出越鞠丸与抑郁共有基因3个:ESR1、AR、GSK3B;苍术与抑郁的共有基因1个:SLC6A4;香附和抑郁的共有基因5个:MAPK14、HTR2C、MAOA、HTR3A、LTA4H;苍术、香附、栀子与抑郁的共有基因2个:TP53、CHRM2;香附、川芎、栀子和抑郁的共有基因1个:NR3C1;苍术、香附和抑郁的共有基因5个:SLC6A2、PTGS2、HTR2A、SLC6A3、DRD1;香附、栀子和抑郁的共有基因3个:CYP1A2、CCL2、CYP3A4;即越鞠丸对活性化合物作用靶点与抑郁共有20个交集基因。见表2,图2。
  
  2.4 越鞠丸与抑郁蛋白质相互作用核心网络(PPICN)的构建与筛选
  
  将“2.3”得到的20个交集基因带入STRING进行分析,PPICN(图3)包含20个节点,66条边,其中节点表示蛋白,每条边则表示蛋白与蛋白之间的相互作用关系,线条越粗表示关联度越大,其中平均节点度值为6.6。
  
  2.5 靶点通路分析
  
  利用David数据库对筛选出的20个核心靶点蛋白进行GO和KEGG通路富集分析,GO功能富集分析中生物过程57条富集结果(P<0.05),主要涉及DNA生物合成过程、细胞周期停滞过程、细胞大分子分解过程、高分子分解过程、细胞周期负调节过程、蛋白质修饰过程的负调节过程、细胞周期的调控等方面;分子功能获得27条富集结果(P<0.05),涉及血红素结合、DNA结合、转录因子结合、酶结合、蛋白磷酸酶2A结合、类固醇激素受体活性、氧化还原酶活性等方面;细胞组成获得13条富集结果(P<0.05),涉及蛋白质复合物、细胞质、神经元包体、细胞膜、轴突、树突等方面见图4。
  
  KEGG通路分析共获得23条通路,其中P<0.05的前20条通路包括6条信号通路,3条代谢通路,4条生物系统相关通路(涉及神经系统及循环系统),3条疾病通路(肿瘤和感染性疾病),具体为含血清素的神经突触通路、多巴胺能神经突触通路、刺激神经组织的中的交互通路、可卡因成瘾通路、钙信号通路、安非他命上瘾通路、药物代谢-细胞色素P450通路、催乳激素信号通路、化学致癌作用通路、前列腺癌通路、缝隙连接通路、TRP通道炎症介质调控通路、肿瘤坏死因子信号通路、甲状腺激素信号通路、生成信号通路、丙型肝炎通路。并通过Omicshare对富集分析结果进行可视化处理。结果见图5,表3。
  
  3 讨论
  
  实验研究发现越鞠丸能够迅速诱导抗抑郁作用,并确认栀子为关键成分,川芎与栀子的协同效应促进海马区神经元发生发挥抗抑郁作用[11-13];川芎可以发挥改善脑血流、调控凋亡基因的表达、抗自由基损伤以及降低免疫炎症反应等作用从而活血护脑抗抑郁[14];栀子-川芎组合可以明显恢复BDNF和TrkB的水平,改善神经可塑性,是快速抗抑郁的作用机制之一[12,15]。虽然对越鞠丸各主要成分的药理学作用已基本明确,但是作为复方研究其治疗心身疾病的确切靶点却鲜有报道。
  
  本研究结果显示,越鞠丸31个活性化合物作用于157个靶点,其中苍术中含有MOL000173(wogonin黄芩素)潜在靶标有35个、MOL000188(3β-acetoxyatractylone乙酰氧基苍术酮)潜在靶标有25个,研究发现汉黄芩素能够剂量相关性地激活雌激素受体ERα,降低脂多糖(LPS)刺激小胶质细胞产生的一氧化氮和炎性因子发挥神经保护作用,也有研究证明黄芩素通过阻断非受体酪氨酸激酶JAK-1和JAK-3降低STAT1和STAT3通路的磷酸化和活性发挥抗炎作用[16-17];苍术酮具有保肝、抗肿瘤、细胞毒性、抗炎等活性[18]。香附和栀子中都含有MOL000098(quercetin槲皮黄酮),研究发现槲皮黄酮可通过调节谷氨酸和一氧化氮发挥抗抑郁、抗氧化作用[19-20];川芎中的MOL002135(Myricanone杨梅酮)潜在靶标有24个,杨梅酮是一种典型的黄酮类衍生物,有抗氧化活性和外周镇痛活性[21],现有的研究报道与我们本次研究结果相一致。研究结果提示越鞠丸复方的抗抑郁作用并不体现在某个单味药或某单体成分上,而是方中某些单味药组方配伍综合作用的效果,研究认为栀子-川芎为越鞠丸中发挥抗抑郁的关键药对[15]。
  
  雌激素受体1(ESR1)通过甲状腺激素通路参与DNA相互作用转录表达,甲状腺激素水平的减退会导致脑白质损伤[22-23],雌激素可通过雌激素受体在脑内与抑郁症相关神经递质、神经营养因子及HPA轴相关激素发生作用[24],进而影响抑郁症的发生。雄激素主要依赖脑内雄激素受体(AR)调节雄性动物的情绪及情感反应,能够通过缝隙连接通路参与调节成年脑的突触可塑性,促进学习记忆,正向调节良好情绪状态,MAPK/ERK信号通路可能参与了这一过程的调节[25-26]。GSK3β(丝氨酸蛋白激酶)作为磷酸化磷酸酶(PTEN)的上游蛋白,通过PTEN激活下游PI3K/Akt通路,继而促进小胶质细胞M2作用[22]。本研究显示ESR1、AR、GSK3β是越鞠丸潜在抗抑郁靶点,提示越鞠丸可能是通过调节神经递质、细胞的突触可塑性和炎症反应起到抗抑郁作用。
  
  本研究通过计算机挖掘网络药理学数据库方法对越鞠丸进行靶点预测和通路分析,对其活性成分的抗抑郁作用机制进行探究。结果显示其抗抑郁靶点主要有ESR1、AR、GSK3B等20个基因,可能是通过参与突触传递负调节、多巴胺分解转运过程、基因表达正调控、信号转导、记忆、药物反应、对雌二醇的反应和磷脂酶C激活G蛋白偶联受体及5-羟色胺受体信号通路来发挥作用,为其后续临床试验疗效评价指标的筛选提供依据和方向,从而明确越鞠丸的主要调控靶点。
  
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