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基于网络药理学探讨四至丸治疗绝经后骨质疏松的作用机制

更新时间:2020-12-08 09:54点击:

  摘    要:
  
  目的:探索四至丸防治绝经后骨质疏松的关键靶点及药物作用机制。方法:通过检索GeneCards、OMIM、DisGeNET、Phenopedia等疾病数据库,确定绝经后骨质疏松相关的靶点,然后通过TCMSP数据库筛选出四至丸中活性化学成分和对应靶点,并通过R语言筛选出药物与疾病的共同靶点,构建“药物-候选化合物-靶点-疾病”网络图。使用STRING数据库和Cytoscape软件,构建PPI网络,使用R语言对四至丸治疗绝经后骨质疏松的关键靶点进行GO和KEGG富集分析,确定四至丸治疗本病的核心靶点和作用机制。结果:四至丸的有效化学成分共42个,基因靶点199个,疾病靶点1070个,共同靶点114个,预测JUN、AKT1、IL6、MAPK1、RELA、MAPK14等蛋白可能是四至丸防治绝经后骨质疏松的关键靶点。GO富集分析确定了2244个条目,四至丸可能通过抑制氧化应激反应、调控炎症因子、增强营养、类固醇激素样作用防治绝经后骨质疏松。KEGG通路富集分析明确了150条信号通路,其中信号通路涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、动脉粥样硬化信号通路、PI3K-Akt信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染通路、乙型肝炎信号通路等。结论:四至丸组方配伍严谨科学,通过干预相关疾病途径,调控代谢相关通路、调节雌激素水平等方式防治绝经后骨质疏松,为四至丸作用机制的阐述提供新的思路和线索。
  
  关键词:
  
  网络药理学 四至丸 骨质疏松 作用机制
  
  绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是一种由雌激素水平降低引起的全身性骨病,以骨量低,骨组织微结构破坏,导致骨折风险和骨痛增加为特征[1],严重影响患者的生活质量。本病多发生在女性绝经后5-10年内。我国50岁以上人群骨质疏松症(osteoporosis,OP)患病率女性为20.7%,60岁以上人群OP患病率明显增高,女性尤为突出[2-3]。中医经典明方二至丸出自《扶寿精方》,其临床应用十分广泛,具有补肝肾之阴的作用,能够“理腰膝,壮筋骨”,用于治疗OP历史悠久[4]。四川省名中医高永翔教授根据临床经验,以二至丸加味后自拟四至丸(女贞子、墨旱莲、淫羊藿、当归)治疗本病,具填精益肾、活血化瘀之效,临床疗效显著。但该方物质基础和作用机制尚不清楚,本研究将运用网络药理学方法,预测四至丸治疗PMOP的主要成分及其作用途径,为研究四至丸抗PMOP的物质基础和作用机制新的思路和线索。
  
  1 资料与方法
  
  1.1 绝经后骨质疏松疾病靶点的查询
  
  以“Postmenopausal Osteoporosis”为关键词分别对GeneCards数据库、OMIM数据库、DisGeNET数据库、Phenopedia数据库进行已知的疾病相关靶点的查询筛选。
  
  1.2 四至丸中药物化学成分和靶点蛋白的筛选
  
  以四至丸中所含中药“女贞子”、“墨旱莲”、“淫羊藿”、“当归”为检索词,在中药系统药理学数据库分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)检索,通过药物相似性(drug-like-ness,DL)≥0.18和药物口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%对数据进行筛选,获得药物所有化学成分和靶点蛋白数据。运用Perl软件和Uniprot数据库确定四至丸活性成分作用靶点。
  
  1.3 “药物-候选化合物-靶点-疾病”网络的构建
  
  通过R语言将四至丸药物靶点蛋白与PMOP疾病差异基因取交集,获得其中的共同靶点。利用Cytoscape软件构建“药物-候选化合物-靶点-疾病”网络图。
  
  1.4 蛋白质相互作用(protein protein interaction,PPI)网络的构建与关键靶点的筛选
  
  将共同靶点导入STRING数据库,最低交互作用分数设置为>0.9,其余参数采用默认值,建立PPI网络。运用Cytoscape软件对PPI网络进行构建及分析,依据蛋白互作次数对其进行排序。
  
  1.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析
  
  利用R软件对“药物-候选化合物-靶点-疾病”网络的靶点蛋白进行GO功能富集分析和KEGG通路分析。通过Cytoscape软件对KEGG富集分析中获得的关键基因和通路进行“基因-信号通路”网络关系构建。
  
  2 结果
  
  2.1 绝经后骨质疏松的疾病相关靶点
  
  经过GeneCards数据库、OMIM数据库、DisGeNET数据库、Phenopedia数据库查询后,分别检索获得PMOP疾病相关靶点1073、54、171、190个,整合并删除重复靶点后共获得1070个靶点蛋白。
  
  2.2 四至丸药物活性成分和靶点蛋白的筛选结果
  
  通过TCMSP数据库检索并筛选出四至丸中所含中药活性成分分别为女贞子13个、墨旱莲10个、淫羊藿23个、当归2个,去除重复后共获得42个化学活性成分(表1)。在TCMSP数据库中获得四至丸中所含中药所有化学成分相关靶点蛋白3276个,去除重复后运用Perl软件确定四至丸中化学活性成分作用靶点共199个。
  
  2.3 “药物-候选化合物-靶点-疾病”网络
  
  运用R语言将筛选出的100个潜在药物靶点和1070个PMOP疾病相关靶点取交集,得到114个重叠靶点(图1),涉及33个候选化合物。根据以上重叠靶点及候选化合物,利用建立“药物-候选化合物-靶点-疾病”网络(图2)并分析。该网络图结果显示,四至丸的化学活性成分与作用靶点存在不同程度的相互关系398个,按节点度值(degree)降序排列得出该复方关键活性化合物(表2)。
  
  2.4 PPI网络图的分析
  
  通过STRING数据库在线构建PPI网络图,该网络图包括蛋白108个,4188条关系线条。导出PPI相关数据后,运用Cytoscape 3.7.3软件对其进行分析,按照节点度值排序(图3),在PPI网络中degree降序排列中前20的靶点如表3所示。
  
  2.5 GO功能富集分析
  
  运用R语言,通过Bioinformatics平台进行GO富集分析,搜集到2244条,其中包括细胞组成条目(CC)56条,分子功能条目(MF)132条,生物过程条目(BP)2056条。根据p值对GO富集分析结果进行整理,筛选出前20个条目,结果显示,这些蛋白主要分布在细胞膜阀筏(membrane raft)、膜微结构域(membrane microdomain)、膜区(membrane region)、囊腔(vesicle lumen)、转录调节复合物(transcription regulator complex)等(图4);主要分子功能有细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)、DNA-结合转录激活因子活性和RNA聚合酶-特异性(DNA−binding transcription activator activity,RNA polymerase II−specific)、受体配体激活(receptor ligand activity)、细胞因子激活(cytokine activity)、磷酸酶结合(phosphatase binding)等(图5);主要参与氧化应激反应(response to oxidative stress)、对脂多糖的反应(response to lipopolysaccharide)、对细菌来源分子的反应(response to molecule of bacterial origin)、对营养水平的反应(response to nutrient levels)、类固醇激素反应(response to steroid hormone)等过程(图6)。
  
  2.6 KEGG通路分析
  
  运用R软件,通过R软件中的Bioinformatics平台进行KEGG通路富集分析,搜索到结果共150条。根据p值和靶点计数筛选出前20条通路,包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE−RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流体剪切应力与动脉粥样硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、PI3K-Akt信号通路(PI3K−Akt signaling pathway)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染(Kaposi sarcoma−associated herpesvirus infection)、乙型肝炎(Hepatitis B)等(图7)。根据靶点基因和KEGG通路的关联度,对其节点度值进行统计,运用Cytoscape软件构建“基因-通路”网络,使靶点基因与信号通路的关系可视化。
  
  3 讨论
  
  绝经后骨质疏松症属于高转换型骨质疏松,骨吸收和骨形成均活跃。本病主要是由于雌激素对破骨细胞有抑制作用,绝经后雌激素水平降低,破骨细胞的凋亡减少、寿命延长、数量增加,导致骨吸收功能增强。成骨细胞介导的骨形成同时也有增加,但不能代偿骨吸收,这就造成骨吸收过度,骨小梁变细或断裂,骨组织微结构被破坏,最终导致骨强度下降,出现骨折和风险和骨痛增加。同时雌激素减少会降低骨骼对力学刺激的敏感性,使骨骼呈现类似于废用性骨丢失的病理变化[5-7]。骨质疏松症在中医中属“骨痹”、“骨乏”、“骨痿”等的范畴。中医学认为本病的病因病机为肾精亏虚、脾虚,日久累及元气亏虚,无力推动血运,导致血脉瘀滞[8]。高永翔教授根据PMOP中医病因病机和临床表现,自拟四至丸,常予四至丸加味治疗本病。该方组方简单,其中女贞子、墨旱莲(二至丸)益肝肾、补阴血,行养阴益精之功;淫羊藿有补肾阳,强筋骨,祛风湿之功,填精补血,为培助下元之首药,与二至丸配伍阴阳相济;佐以当归补血活血、通经活络,使四至经络畅通;同时淫羊藿与当归配伍,一者入肾,一者入肝,合而护养精血。
  
  本文研究显示四至丸主要通过槲皮素、木犀草素、山奈酚、金合欢素、淫羊藿苷元等活性化学成分对JUN、AKT1、IL6、MAPK1、RELA、MAPK14、ESR1等基因为关键靶点的AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、PI3K-Akt信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、乙型肝炎等通路作用于绝经后骨质疏松症。
  
  四至丸与PMOP的共同靶点共114个,其中当归55个,墨旱莲266,女贞子314个,淫羊藿445个。这与目前临床研究中治疗OP的内服药物频次一致,温补肝肾类药物为首选,其次为养血活血类药物[9-10]。在对这四味药的现代药理学研究中发现,二至丸具有保肝降酶、增强免疫调节、改善血液系统功能、抗肿瘤、改善骨质疏松、抗衰老抗氧化、植物雌激素样作用,在改善骨质疏松的研究中发现二至丸作用于大鼠,大鼠能够有效促进成骨细胞的增殖和矿化作用,抑制破骨细胞分化和再吸收[11-15]。淫羊藿作为治疗PMOP常用中药[9],其抗骨质疏松作用十分突出,已有研究表明,淫羊藿中的淫羊藿总黄酮或黄铜各单体都具有抗骨质疏松的作用,其中以淫羊藿苷作用最强,可促进成骨细胞增殖,诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[16]。当归与淫羊藿之PMOP防治的核心药对之一[10]。在一项关于中药治疗骨质疏松症的用药规律的研究中,发现活血化瘀类中药中以当归用药频率偏高。目前为止,当归活性提取物主要是阿魏酸钠和当归多糖两类,阿魏酸钠和当归多糖均已被证实是从促进骨形成和抑制骨吸收等作用来治疗骨质疏松[18-21]。
  
  利用PPI网络筛选出关联性最高的基因有JUN、AKT1、IL6、MAPK1、RELA、MAPK14、ESR1等。JUN蛋白是转录因子AP-1家族中的一个成员,包含c-Jun、JunB、JunD可以相互之间形成同源二聚体,也可以和Fos家族的蛋白形成异源二聚体发挥转录因子的作用,参与OP中成骨细胞的凋亡[22]。AKT1蛋白参与多种生物学过程,包括代谢、增殖、细胞存活、生长、胰岛素信号传导和血管生成等,AKT激活依赖于PI3K途径,被认为是该途径的关键节点。IL-6是一种功能广泛的细胞因子,可调节多种细胞的生长和分化,具有调节免疫应答、急性期反应及造血功能,在机体抗感染免疫反应中起到重要作用,在慢性炎症反应中也扮演着重要角色。在PMOP患者血清中IL-6和TNF-α水平均升高,可能与OP的发病有关[22-23]。MAPK1、MAPK14均是MAP激酶家族的成员,MAP激酶参与细胞增殖、分化、转录调控和发育等过程。RELA(p65)属于NF-κB家族成员,NF-κB是一系列信号转导时间的终末点,参与炎症、免疫、细胞分化、生长、肿瘤的发生和凋亡等。ESR1为雌激素受体,与ESR2形成同型二聚体或异性二聚体,雌激素受体与PMOP密切相关[24]。
  
  在GO富集分析中发现四至丸可能主要通过抑制氧化应激反应、调控炎症因子、增强营养、类固醇激素样作用治疗PMOP。氧化应激状态能够抑制成骨细胞的分化,刺激破骨细胞分化,促进OP的发生发展,是OP的一个危险因素[25]。绝经后妇女及老年人体内常常处于微炎症状态,炎症因子可通过多种途径,特别是RANK/RANKL/OPG通路影响骨代谢,导致和加重OP的发生发展[26]。类固醇激素包括肾上腺皮质激素和性激素等,这对于防治PMOP具有重要作用,可以改善患者雌激素的缺乏,对炎症具有抑制作用。
  
  在KEGG通路富集分析显示四至丸可能通过糖尿病并发症的晚期糖基化终末产物—晚期糖基化终末产物受体(AGE-RAGE)信号通路、动脉粥样硬化信号通路、PI3K-Akt信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、乙肝信号通路、癌蛋白多糖通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、缺氧诱导因子信号通路、结直肠癌通路等。一般认为 2 型糖尿病与维生素D水平相关,糖代谢与骨代谢关系密切,胰岛素拮抗增强,患者发生OP风险显著升高[27-28]。近年来有些大型流行病学研究提示绝经后骨疏松与冠状动脉疾病、脑血管疾病之间有显著的相关性[29-30],二者可能存在共同的发病机制,例如存在于脉管中的骨代谢标志物(骨钙素、骨形态发生蛋白、骨桥蛋白和骨保护素)可能引起动脉粥样硬化,而引起动脉粥样硬化的炎性因子(NF-κB和一氧化氮)具有调节骨代谢的作用[31]。PI3K-Akt信号通路是成骨细胞分化增殖的重要途径,研究发现,PI3K-Akt通路可通过拮抗氧化应激反应而减少成骨细胞凋亡,进而减少OP的发生[32-33]。根据网络分析,四至丸防治PMOP的靶点复杂,通路多样,目前还需进一步探索,以证实其作用机制。
  
  4 总结
  
  本研究借助网络药理学初步明确四至丸的作用机制,该方通过多成分、多靶点、多通路治疗绝经后骨质疏松。后续研究将在此及出生对核心靶点进行分子对接,进一步筛选出四至丸中有效成分和作用八点,并通过相关体内、外实验进行验证,以进一步探索四至丸骨保护的作用机制,为临床治疗PMOP提供理论和实验依据。
  
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