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基于网络药理学研究杞菊地黄丸治疗糖尿病眼病的作用机制

更新时间:2020-12-08 10:01点击:

  摘    要:
  
  目的 基于网络药理学探讨杞菊地黄丸治疗糖尿病眼病的作用机制。方法 通过中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)检索杞菊地黄丸中的药物成分,并筛选出有效活性成分,然后通过TCMSP数据库预测相应靶点,再将预测的靶点输入到UniProt中转换为相应的基因,构建杞菊地黄丸有效成分的靶点网络,再通过PharmGKB数据库检索糖尿病眼病相关基因,构建糖尿病眼病靶点网络,合并杞菊地黄丸有效活性成分的靶点网络与糖尿病眼病的靶点网络,通过筛选取得核心基因团。最后利用DAVID对筛选出的核心基因团进行GO注释和KEGG通路分析。结果 杞菊地黄丸有96个有效活性成分,94个靶点,糖尿病眼病有43个相关基因,筛选出核心基因团180个,富集通路主要为甲状腺激素、MAPK、FoxO、PI3K/Akt、胰岛素信号通路。结论 杞菊地黄丸的有效活性成分治疗糖尿病眼病可能与甲状腺激素、FoxO与胰岛素的信号通路串话、MAPK、PI3K/Akt等信号通路相关。
  
  关键词:
  
  杞菊地黄丸 糖尿病眼病 网络药理学
  
  糖尿病眼病是糖尿病的常见并发症之一,其发生与血糖波动趋势呈正相关[1]。糖尿病以血糖异常升高为主要临床特征[2],患者长期处于高血糖状态,易导致糖尿病眼病的发生,糖尿病眼病是最常见的慢性糖尿病并发症之一,极易导致患者视功能损害甚至失明[3]。因此,严格控制血糖水平,对于减少糖尿病视网膜病变的发生及延缓糖尿病视网膜病变的发展极其重要[4]。英国对糖尿病性眼病的最新流行病学统计结果表明,威胁视力的糖尿病相关眼病的年发病率为1.21/10 000[5]。现如今,我国糖尿病发病率高达9.6%,居全球第二,而且发病年龄出现年轻化趋势[6],因此,预防和控制糖尿病眼部并发症已经成为临床关注的焦点。杞菊地黄丸乃滋阴养肝明目之经典方剂,多个研究已证实了杞菊地黄丸确能有效治疗糖尿病眼病,改善患者的生活质量[7-9]。虽然运用杞菊地黄丸治疗糖尿病眼病有显著的临床效果,但是中药治疗疾病具有多靶点、多通路的特点,因此,其具体作用机制尚未可知。本研究基于网络药理学知识预测杞菊地黄丸防治糖尿病眼病的主要作用机制,以期为今后糖尿病眼病的治疗及相关机制研究提供参考。
  
  1 方法
  
  1.1 杞菊地黄丸的药物成分筛选
  
  将杞菊地黄丸各药物成分输入到中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)中,检索杞菊地黄丸方剂中的所有药物活性成分[10-11]。
  
  1.2 杞菊地黄丸的药物有效活性成分筛选
  
  以“化合物口服生物利用度≥30%”和“化合物类药性≥0.18”为筛选条件,对杞菊地黄丸的药物活性成分检索结果做进一步的化学成分筛选[12]。
  
  1.3 杞菊地黄丸的药物有效活性成分靶点预测
  
  运用TCMSP数据库对筛选出来的杞菊地黄丸中的各药物有效活性成分进行靶点预测。
  
  1.4 杞菊地黄丸靶点蛋白的基因转换
  
  运用Uni Prot中的人组织标本(“Organism”选项选择“Homo sapiens Human”)将杞菊地黄丸中预测的靶点蛋白转换为相对应的人类基因。
  
  1.5 杞菊地黄丸靶点网络的构建
  
  将上述杞菊地黄丸虚拟筛选出的86个有效活性成分和预测得到的靶点基因进行合并,然后将其输入Cytoscape中,构建出“杞菊地黄丸靶点网络”。
  
  1.6 糖尿病眼病的靶点网络构建
  
  在Pharm GKB数据库中搜索跟糖尿病眼病相关的疾病基因,然后将搜索出的糖尿病眼病相关基因导入Cytoscape中,选择该软件中的Bisogenet插件,绘制出糖尿病疾病的基因-蛋白相互作用的靶点网络。
  
  1.7 药物有效成分与疾病靶点的网络合并
  
  将杞菊地黄丸靶点网络和糖尿病眼病的疾病靶点网络输入到Cytoscape软件中,采用Cytoscape里的Merge插件将二者进行合并。
  
  1.8 筛选出网络合并后的核心基因团
  
  Degree以17的倍数设置筛选条件,筛选出核心基因团,数量控制在100~200,最终确定Degree为51~119,筛选出核心基因团共计180个。
  
  1.9 基因富集分析
  
  将上述筛选出的核心基因团输入到DAVID网站中,选择GO富集分析和KEGG通路分析对核心基因团进行更深层次的剖析,从基因层面和信号通路层面阐述杞菊地黄丸有效活性成分的靶点蛋白。
  
  2 结果
  
  2.1 杞菊地黄丸的药物有效活性成分筛选
  
  通过TCMP数据库检索到杞菊地黄丸的药物活性成分总计770个(菊花74个,枸杞188个,茯苓34个,泽泻46个,牡丹皮55个,山茱萸226个,山药71个,熟地76个)。阈值设定为“化合物口服生物利用度≥30%”和“化合物类药性≥0.18”共筛选出151个有效活性成分(菊花9个,枸杞36个,茯苓13个,泽泻10个,牡丹皮55个,山茱萸14个,山药12个,熟地2个),各药物之间有55个重复的有效活性成分,剩余总计96个无重复的有效活性成分。
  
  2.2 杞菊地黄丸中的药物有效活性成分靶点预测
  
  在TCMP数据库中找出上述预测的杞菊地黄丸的有效活性成分对应的靶点蛋白,总计94个,再通过Uni Prot数据库将其转换为相应的基因名。
  
  2.3 杞菊地黄丸靶点网络的构建
  
  通过Cytoscape软件绘制“杞菊地黄丸靶点网络”,其中杞菊地黄丸药物有效活性成分总计96个(剔除数据库中无法检索对应靶点的有效活性成分,剩余总计86个),用六边形表示靶点(总计94个),有效活性成分与靶点之间的连线(总计1060条)代表二者之间的关系。见图1。
  
  2.4 糖尿病眼病的靶点网络构建
  
  通过Pharm GKB数据库检索出43个糖尿病眼病相关基因,将这43个基因输入Cytoscape中,选用Bisogenet插件进行在线检索,检索出相应蛋白总计1 153个,构建出的糖尿病眼病靶点网络图中包含20 292条边,代表疾病基因与相应蛋白的关系。
  
  2.5 药物有效成分与疾病靶点的网络合并与筛选
  
  将“杞菊地黄丸-靶点网络”和“糖尿病眼病-靶点网络”输入到Cytoscape中,选择Merge插件将二者进行合并,形成“杞菊地黄丸-靶点-糖尿病眼病”网络。设置Degree值为51~119,筛选出180个核心基因团。该图中黄色三角为杞菊地黄丸药物的有效活性成分,红色三角为糖尿病眼病相关基因,蓝色正方形为二者共同作用的基因。见图2。
  
  2.6 基因富集分析
  
  将“杞菊地黄丸-靶点-糖尿病眼病”网络中筛选的180个核心基因团导入DAVID中,对该核心基因团进行GO注释和KEGG通路分析。
  
  富集的细胞组件中,根据P≤0.05,相关基因数目从大到小排名前十的细胞组件分别为细胞核、核质、细胞质、核仁、核染色质、PML核小体、催化步骤2剪接体、PCG蛋白复合物、Mre11复合物、伪足。见图3。
  
  富集的分子功能中,根据P≤0.05,相关基因数目从大到小排名前十的分子功能分别为ATP结合、Poly(A)RNA结合、染色质结合、转录辅阻遏子活性、RNA聚合酶Ⅱ远端增强子序列特异性DNA结合、核心启动子结合、组蛋白乙酰转移酶活性、端粒DNA结合、配体依赖性核受体结合。见图4。
  
  富集的生物学过程中,根据P≤0.05,相关基因数目从大到小排名前十的生物学过程分别为RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的负调控、DNA模板转录、血管再生、基因表达的昼夜节律调控、对细胞生长负调控、端粒维持、DNA损伤检查站、泌乳、肽基-赖氨酸脱乙酰化。见图5。
  
  富集的相关通路中,根据P≤0.05,按相关基因数目从大到小排名前五的相关通路为甲状腺激素信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、Fox O信号通路、PI3K-Akt信号通路、胰岛素信号通路。见图6。
  
  3 讨论
  
  糖尿病在中医里属“消渴”范畴,消渴之名首见于《素问·奇病论》,中医认为糖尿病的主要病机在于阴津亏损、燥热偏盛,阴虚为本,燥热为标。对糖尿病眼部并发症的首次记载见于刘河间的《宣明论方·消渴总论》,言“消渴”一证可变为“雀目或内障”,认为主要病机是消渴日久、肾阴亏虚、肝失濡养、肝肾精血不足、不能上承于目。西医认为糖尿病眼病与性别、年龄等无明显关联,但与血糖变化明显相关。患者血糖长期处于增高状态或血糖发生明显波动,极易导致糖尿病眼病的发生,造成患者视功能损害甚至失明,对患者生命安全和健康造成了严重威胁。杞菊地黄丸首见于《麻疹全书》,是滋阴补肾之经典主方,由六味地黄丸加枸杞子、菊花各三钱,研为细末,练蜜为丸而成。方中熟地、山茱萸补肝肾之阴,山药既补先天之肾精,又补后天之脾胃,三药合用,肝脾肾三阴并补;但所谓虚不受补,滋养之品最易碍胃,因此泽泻利湿泄,防熟地滋腻,牡丹皮清泄相火制茱萸温涩,茯苓健脾渗湿助山药健脾,三药合用泻湿浊而降相火。枸杞子乃滋补肝肾之佳品,菊花可清肝明目,《用药心法》言菊花可“去翳膜,明目”,杞菊合用一清一补,共奏益精明目之效。多项临床显示,杞菊地黄丸防治糖尿病眼病的疗效颇佳,但中药治疗疾病具有多靶点、多通路的特点,因此,其具体机制尚不明确。研究杞菊地黄丸治疗糖尿病眼病的机制,可以为糖尿病眼病的临床防治提供重要参考价值。
  
  本研究基于网络药理学知识预测杞菊地黄丸作用于糖尿病眼病的通路及可能机制,以期为糖尿病眼病的临床治疗提供参考。根据研究结果推测,杞菊地黄丸的有效活性成分治疗糖尿病眼病可能与“甲状腺激素信号通路”“Fox O信号通路与胰岛素信号通路串话”“MAPK信号通路”“PI3K/Akt信号通路”相关。
  
  甲状腺激素信号通路中的甲状腺激素是一种氨基酸衍生物,可以调控机体的新陈代谢,加速胰岛素降解,也可以调控机体对胰岛素的敏感性[13],双向调控胰岛功能,控制血糖水平。此外,甲状腺激素可以通过调节肝糖原的输出、糖异生量以及葡萄糖利用率等机制,从而控制血糖水平,防控糖尿病眼病的发生发展[14]。傅雯雯[15]对687例糖尿病眼病患者进行统计分析,证实了甲状腺激素水平与糖尿病眼病的相关性。糖尿病眼病的防治关键在于控制血糖水平的稳定,因此可以推测出,杞菊地黄丸可能是通过甲状腺激素信号通路,维持血糖平衡,进而防治糖尿病眼病的发生发展。
  
  Fox O信号通路、胰岛素信号通路和慢性糖尿病相关密切,Fox O信号通路产生的Fox O因子可加速脂肪分解[16];胰岛B细胞是胰岛细胞的一种,属于内分泌细胞,是胰岛素的主要分泌细胞,能通过调节胰岛素的分泌量调控血糖水平,同时Fox O因子对胰岛B细胞还有保护作用。Fox O信号通路与Notch信号通路串话,抑制胰岛B细胞的生长分化,维持其生理特性。此外,Fox O通过促进抗氧化酶表达,使机体分泌出大量的抗氧化酶,从而保护胰岛B细胞[17]。因此,结合KEGG的富集结果推测,杞菊地黄丸可能通过Fox O信号通路与胰岛素信号通路串话,控制血糖水平,防治糖尿病眼病的发生发展。
  
  MAPK是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要信使,在基因表达以及细胞质功能活动的调控中发挥至关重要的作用[18]。细胞接收到的信号通过MAPK信号通路传进入细胞内部,结合KEGG富集分析结果推测,杞菊地黄丸有效活性成分调控血糖可能是通过MAPK信号通路将有效活性成分由细胞外部传输到细胞内部,进而调控胰岛细胞对血糖的控制,减少糖尿病眼病的发生。
  
  PI3K/Akt信号通路在胰岛素相关信号通路中占有不可或缺的地位,其表达量与人体葡萄糖代谢程度呈正相关[19]。PI3K/Akt信号通路的高表达可提高人体内葡萄糖的转运功能,提升葡萄糖的利用率,降低血液中葡萄糖含量,控制血糖水平。结合KEGG富集结果推测,杞菊地黄丸有效活性成分可能是通过PI3K/Akt信号通路高表达,提高葡萄糖利用率,防治糖尿病眼病的发生发展。
  
  综上所述,基于网络药理学知识的试验研究结果推测,杞菊地黄丸可能是通过以下几个通路来防治糖尿病眼病的发生发展:(1)调控甲状腺激素信号通路,维持血糖平衡,进而防治糖尿病眼病的发生发展;(2)通过Fox O通路与胰岛素通路串话调控机体血糖水平,防控糖尿病眼病发生发展;(3)通过MAPK通路将杞菊地黄丸有效活性成分由胞外转运到胞内,进行调控胰岛细胞对血糖的控制,防治糖尿病眼病的发生发展;(4)通过上调PI3K/Akt通路,提高葡萄糖利用率,防治糖尿病眼病的发生发展。
  
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