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基于网络药理学分析甘草马钱子配伍治疗重症肌无力潜在靶点与机制研究

更新时间:2020-12-21 08:35点击:

  摘    要:
  
  目的:利用网络药理学技术探讨甘草马钱子配伍治疗重症肌无力(Myasthenia Gravis, MG)的作用机制。方法:从TCMID数据库、中药系统药理学数据库和分析平台数据库挖掘甘草-马钱子活性成分及作用靶点;通过TTD数据库、Gene Cards数据库以及OMIM数据库获取MG的预测靶点。利用Cytoscape3.7.1软件,构建“药物-靶点-疾病”网络;应用STRING11.0软件,进行网络分析,筛选甘草-马钱子治疗MG的核心靶点。DAVID6.8数据库和KOBAS 3.0数据库对药物与疾病的共同靶点进行GO功能富集和KEGG信号通路分析,并利用omicshare数据库进行结果可视化。结果:从甘草-马钱子治疗MG疾病中筛选出84个活性成分和67个共有靶点,核心靶点有RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6),血管内皮生长因子A(VEGFA)、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)、Toll样受体4(TLR4)、CXC趋化因子受体4型(CXCR4)等。GO功能富集分析结果显示,甘草-马钱子参与信号的传导、刺激反应、生物过程信号的正或负调控以及细胞、代谢、发育等多种生物过程,主要作用于细胞及细胞器。KEGG通路富集分析结果显示,甘草马钱子配伍可以调控T细胞受体、Toll样受体、TNF、PI3K-AKT等信号通路。结论:甘草马钱子配伍治疗MG的作用机制具有多成分、多靶点的作用特点,参与MG相关的信号通路,调节复杂的生物过程有关。
  
  关键词:
  
  甘草 马钱子 重症肌无力 网络药理学 作用机制
  
  重症肌无力是由乙酰胆碱受体抗体介导的神经-肌肉接头传递障碍的获得性自身免疫性疾病[1]。此病在中医学领域属“痿证”的范畴[2]。中医学认为重症肌无力的前提,是由多种病因引起的,机体脏腑功能受损,代谢紊乱,使得痰、湿、瘀血内生,壅聚于胸腺组织,久则生毒所致[3]。
  
  马钱子作为治疗痿痹痛症的传统中药,始载于《本草纲目》:“消痞块”,具有通络止痛,散结消肿的功效[4]。现代中医药学者利用马钱子的药理学作用,通过风药“通玄达神”[5]“扶助正气”“解毒散结”“通络化瘀”[3]的治疗原则,到达治疗重症肌无力的目的。由于马钱子毒性作用较强,临床常与甘草配伍使用,起到“减毒增效”的效果。因此,本文借助网络药理学技术的研究方法,构建“药物-靶点-疾病”网络,全面、系统地分析活性成分、作用靶点、通路之间的网络关系,阐述甘草-马钱子治疗MG的作用机制,为甘草-马钱子治疗MG作用机制提供新靶点和新思路,也为马钱子临床用药安全提供理论基础。
  
  1 材料与方法
  
  1.1 甘草、马钱子活性成分、靶点的收集和筛选
  
  通过TCMID数据库、中药系统药理学数据库和分析平台数据库和文献检索,对甘草、马钱子化学成分进行检索。以口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)、类药属性(Drug-Like,DL)等ADME参数,筛选出符合条件的中药活性成分[6]。
  
  利用Pub Chem数据库、TCMSP数据库,将甘草、马钱子活性成分转化为SMILES格式,并且利用Swiss Target prediction平台、Pub Chem数据库,进行甘草、马钱子潜在靶点的收集。
  
  1.2 重症肌无力疾病相关靶点的筛选
  
  采用TTD数据库(https://db.idrblab.org/ttd)、Gene Cards数据库以及OMIM数据库[7],以“Myasthenia gravis”为关键词,检索MG疾病相关靶点,并且去除3个数据库重复靶点,建立疾病相关靶点数据集。将甘草、马钱子潜在靶点与重症肌无力相关靶点进行映射,获得三者的共有基因作为甘草-马钱子治疗MG的靶点。
  
  1.3 构建“药物-靶点-疾病”网络
  
  通过将甘草、马钱子活性成分、甘草-马钱子治疗MG靶点的数据导入Cytoscape3.7.1软件,进行“药物-靶点-疾病”网络的构建。其中甘草、马钱子、活性成分、靶点、疾病作为网络的节点,四者之间的关系为网络的边。
  
  1.4 构建蛋白-蛋白相互作用网络
  
  利用STRING 11.0软件,分析功能性蛋白在系统水平上的作用,下载蛋白质-蛋白质文件。将文件导入到Cytoscape3.7.1软件中,进行网络分析,利用Excle筛选出Degree值大于平均值的基因,作为蛋白-蛋白相互作用(Protein-Protein Interactions,PPI)核心基因。
  
  1.5 关键靶基GO富集及KEGG信号通过分析
  
  采用DAVID 6.8数据库和KOBAS3.0数据库对甘草-马钱子治疗MG潜在靶点进行GO功能富集和KEGG信号通路分析。并同时采用Omicshare数据库进行结果可视化。
  
  2 结果
  
  2.1 甘草、马钱子活性成分、靶点的收集和筛选
  
  通过TCMID、TCMSP两个数据库对甘草、马钱子化合物进行搜索,共收集甘草活性成分280个、马钱子活性成分62个。但由于不是所有的化合物都有其药效和药理作用,因此通过TCMSP数据库,ADME参数中,以OB≥30%,DL≥0.18,HL≥4为筛选条件[8],筛选得到甘草中化合物84个,马钱子中化合物15个。并将甘草、马钱子筛选出的活性成分SLIME格式输入Swiss Target prediction与Pub Chem数据库中,检索得到甘草对应的靶点5301个,马钱子对应的靶点551个,去除重复,得到甘草751个潜在靶点,马钱子350个潜在靶点。
  
  2.2 甘草-马钱子配伍治疗重症肌无力疾病相关靶点的筛选
  
  以“重症肌无力”为关键词,在TTD数据库、Gene Cards数据库、OMIM数据库中进行检索,共筛选出574个疾病相关靶点。将MG靶点与甘草、马钱子靶点映射,得到67个甘草-马钱子治疗MG潜在靶点,如图1。
  
  图1 甘草-马钱子活性成分相关靶点与MG疾病相关靶点
  
  图1 甘草-马钱子活性成分相关靶点与MG疾病相关靶点   下载原图
  
  2.3 甘草-马钱子配伍“药物-靶点-疾病”网络的构建
  
  图2 甘草-马钱子活性成分-靶点网络图
  
  图2 甘草-马钱子活性成分-靶点网络图   下载原图
  
  将67个甘草-马钱子治疗MG潜在靶点与甘草、马钱子活性成分进行映射,建立甘草,马钱子活性成分与靶基因对应关系,得到与治疗MG疾病相关甘草、马钱子活性成分共84个。将甘草-马钱子治疗MG疾病的活性成分、靶点导入Cytoscape软件中,建立“药物-靶点-疾病”网络(见图2),共有154节点,864条边。在该网络图中,红色节点代表疾病,蓝色节点代表药物,绿色节点代表治疗靶点,紫色节点代表甘草-马钱子活性成分。通过Network Analyzer计算,筛选出甘草-马钱子degree值≥16的活性成分,分别为鳞叶甘草素A (Glepidotin A)、甘草素、熊果苷(Jaranol)、(S)-马钱子碱[(S)-Stylopine]、番木鳖次碱(Vomicine),可认为这些活性成分在治疗MG疾病中起到重要的药理学作用。结果见表1。
  
  表1 甘草、马钱子活性成分以及OB、DL、HL、degree值     下载原表
  
  表1 甘草、马钱子活性成分以及OB、DL、HL、degree值
  
  2.4 蛋白质-蛋白质相互作用的网络构建
  
  将甘草马钱子配伍治疗MG的靶点输入至STRING数据库进行分析,下载PPI TSV文件,并将其导入Cytoscape软件,分析PPI网络共涉及64个蛋白质节点、475条边(见图3A)。节点的大小和颜色与Degree值正相关,Degree值越大,节点越大,颜色越深,表明靶点在网络关系越重要。因此,筛选出高于Degree平均值的靶点共25个(见图3B),其中RAC-αAKT1、IL-6,VEGFA、TNF、TLR4、CXCR4、转录因子AP-1(JUN)、丝裂原激活的蛋白激酶1(MAPK1)、白细胞介素2(IL-2)、纤连蛋白1(FN1)等在网络中处于关键位置(见图3B),可能在甘草-马钱子治疗MG中发挥重要作用。
  
  2.5 生物功能GO富集分析和KEGG通路富集分析
  
  利用DAVID 6.8数据库、omicshare数据库,将甘草-马钱子治疗MG的靶点进行GO生物过程富集,在分子功能中,甘草-马钱子主要影响结合功能;在生物过程中,甘草马钱子对信号的传导、刺激反应、生物过程信号的正或负调控以及细胞、代谢、发育的过程等起到重要的作用;在细胞组成中,甘草-马钱子主要作用于细胞及细胞器,结果见图4。靶点KEGG通路富集共获得38条富集通路,前20条通路,如图5所示。气泡面积大小代表目标基因数量,气泡颜色代表富集显著性,即P值的大小,Y轴代表pathway名称。其中与MG有关的主要通路包括T细胞受体信号通路(T cell receptor signaling pathway,8)、Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway,8)、TNF信号通路(TNF signaling pathway,8)、Fc-epsilon-RI信号通路(Fc epsilon RI signaling pathway,6)、PI3K-AKT信号通路(PI3K-AKT signaling pathway,8)、雌激素信号途径(Estrogen signaling pathway,6)等。其中以P值最小的T细胞受体信号通路为例,研究甘草马钱子配伍治疗GM靶点的富集情况中有8个靶点,其中AKT、IL-2、TNF-α、LCK、FYN为甘草马钱子配伍的治疗靶点,由此可见甘草马钱子配伍治疗GM是通过多通路、多靶点作用来实现的。结果见图6。
  
  图3 甘草-马钱子治疗MG靶点互作网络
  
  图3 甘草-马钱子治疗MG靶点互作网络   下载原图
  
  图4 甘草-马钱子治疗MG的靶点的生物过程富集分析
  
  图4 甘草-马钱子治疗MG的靶点的生物过程富集分析   下载原图
  
  3 讨论
  
  重症肌无力发病机制复杂,主要是通过机体形成淋巴滤泡,激活体内T、B淋巴细胞,使得T淋巴细胞中Th1/Th2细胞分泌细胞因子,参与免疫应答[9]。马钱子作为传统有毒中药,具有通络、消肿的功效。《串雅补》:“此药走而不守,有马前之名,能钻筋透骨,活络搜风,治风痹遍身骨节疼痛,类风不仁等证。”因此,马钱子在治疗重症肌无力等痿证方面有着独特的作用。
  
  因此,本实验采用网络药理学技术研究甘草马钱子配伍治疗GM作用机制。通过靶点查询及分析,有67个靶点与GM疾病相关。并对这些靶点进行PPI网络分析,结果表明甘草-马钱子配伍后可能经过协同作用参与AKT1、IL-6、VEGFA、TNF、CXCR4、IL-2等靶点,这与中药治疗疾病原则多成分,多靶点特点相吻合。AKT1参与人体许多生理过程,如代谢、增殖、细胞生长等,但主要是AKT可以通过介导胰岛素诱导T细胞的Th易位来负责葡萄糖的摄取及调节[10]。IL-6是一种Th17细胞生产所需的细胞因子,在B细胞分泌lg抗体中起到关键作用,具有多种生物学功能,作用于B细胞、T细胞、肝细胞及、中枢神经细胞,与身体免疫系统的调节有着密切关系[11]。VEGFA是血管内皮生长因子,也被称为血管神经保护因子,可诱导血管的通透性以及神经发生,结合NRP1受体启动了信号传导通路[12]。TNF是一种与炎症相关的细胞因子,可调节机体的免疫系统,是机体免疫系统调节的重要细胞因子,并与多个细胞因子有协同作用[13]。据报道,TNF-α基因启动子-308位点的多态性与MG的发病有关[14]。通过KEGG通路富集分析,甘草-马钱子治疗MG涉及T细胞受体、Toll样受体、TNF、PI3K-AKT等信号通路。T细胞受体信号通路是T细胞表面与TCR结合的抗原信号传递至细胞内的重要途径,在T细胞的功能和免疫突触的形成中起关键作用,T淋巴细胞的激活是免疫系统有效应答的关键[15]。TNF信号通路可促使促炎性细胞因子、趋化因子、生长因子和TNF-α本身等基因的表达放大炎症反应和免疫效应[16]。Toll样受体信号通路是天然免疫系统识别病原微生物的主要受体,而且还使抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cell,APC)识别病原体、产生共刺激信号而启动获得性免疫反应,是人体先天免疫和后天获得性免疫的桥梁。因此,TLRs在人体免疫系统中有着十分重要的作用。PI3K/AKT信号通路在炎症和肿瘤中的作用日益受到重视,PI3K/AKT信号传导通路与细胞因子的调控密切相关,在炎症反应中发挥着重要作用。PI3K/AKT信号通路可激活NF-κB,起到多向性的调节作用,可调节免疫炎症相关的多种细胞的基因表达。在炎症反应的过程中,NF-KB能起到关键的调控作用,能提高诸如IL-Iβ、IL-6等炎症因子的基因转录,增加IL-Iβ、IL-6的表达[17]。
  
  图5 甘草-马钱子治疗GM的靶点的通路富集分析
  
  图5 甘草-马钱子治疗GM的靶点的通路富集分析   下载原图
  
  综上所述,甘草马钱子配伍治疗重症肌无力可能是影响T细胞受体、Toll样受体、TNF、PI3K-AKT等信号通路,进而调节机体的免疫反应、刺激反应、信号传导、生物过程信号的正或负调控以及细胞、代谢、发育等多种生物过程,从而发挥治疗GM的作用。
  
  本研究基于网络药理学技术,首次对甘草马钱子配伍治疗重症肌无力的潜在作用机制进行探讨,从一定程度验证了网络药理学技术的准确性,并揭示了甘草-马钱子配伍治疗重症肌无力多成分、多靶点的特点,为进一步研究甘草-马钱子治疗重症肌无力的作用机制提供参考。
  
  图6 T细胞受体信号通路
  
  图6 T细胞受体信号通路   下载原图
  
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