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基于加权网络药理学的小柴胡汤抗肝癌作用机制研究

更新时间:2020-12-21 08:38点击:

  摘    要:
  
  目的 通过加权网络药理学方法探索小柴胡汤抗肝癌的作用机制。方法 利用TCMSP数据库和文献挖掘相结合的方法收集小柴胡汤的有效活性成分;利用PubChem数据库进行靶点预测并利用“肘点法”筛选优化得到药物靶点集,利用OMIM、Gene Cards、DisGeNET、TTD数据库获取肝癌的疾病靶点集,利用GEO数据库获取肝癌的差异表达基因集;利用STRING数据库构建靶点蛋白互作(PPI)网络并进行GO富集分析和KEGG通路分析;提出了构建化合物-靶点-通路加权网络的方法并进行加权分析,获取加权后的关键靶点和通路;利用Cytoscape构建活性成分-靶点-通路网络图。结果 筛选得到182个有效成分,1241个药物靶点,896个疾病靶点,1569个差异表达基因,最终筛选出907个肝癌靶点。GO功能分析主要与蛋白质激酶活性、催化活性、药物结合等调控有关;KEGG通路主要涉及癌症信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等。结论 小柴胡汤抗肝癌的关键靶点为GAPDH、TP53、ESR1、AKT1、MAPK1等,通过干预癌症信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等发挥抗肝癌作用,体现了中药多成分、多靶点、多通路协同作用机制的特点。
  
  关键词:
  
  小柴胡汤 肝癌 作用机制 加权网络 网络药理学
  
  肝癌是世界范围内发病率排名第三的恶性肿瘤,具有起病隐匿、病情发展快、对放化疗敏感性差、死亡率高、符合手术切除条件的患者比例很小、术后复发率高等特点[1-2]。由于肝癌涉及多基因突变,西药很难通过单一靶点作用而产生良好的疗效,而且容易产生耐药性,不良反应明显。中药复方按照君、臣、佐、使的原则配伍,具有多成分、多靶点、多通路协同作用的特点,越来越受到人们的关注,而且和西药联合应用还能起到减毒增效的效果。中医经典方剂小柴胡汤出自东汉张仲景的《伤寒论》,由柴胡、黄芩、人参、半夏、甘草(炙)、生姜、大枣七味中药组成,是和解少阳的代表方剂,临床试验证明其对肝癌具有显著的治疗作用[3]。传统的网络药理学方法从多成分-多靶点-多通路的角度阐述药物的作用机制,具有较强的整体性,与中医的系统理论相一致[4]。但是在网络分析中只考虑了节点间是否存在关系,而忽略了节点间联系的强弱,因此影响了分析结果的准确性。本研究引入加权算法通过有权网络提升了分析结果的可靠性,为网络药理学分析提供了一种新的思路。
  
  1 材料与方法
  
  1.1 化学成分的收集与筛选
  
  利用 TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)数据库检索小柴胡汤的有效活性成分,并根据口服生物利用度(OB)大于等于30%和类药性(DL)大于等于0.18 进行筛选,利用文献挖掘的方法对小柴胡汤的有效活性成分进行补充和完善,构建小柴胡汤的活性成分数据库。
  
  1.2 构建小柴胡汤的药物作用靶点集
  
  将收集到的活性成分利用 PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)数据库预测其在大于 95%相似度下的靶点集,并利用 TCMKD 1.0(traditional Chinese medicine knowledge disco-very database)对每个活性成分的预测靶点集进行“肘点法”筛选优化,利用 UniProt(https://www.uniprot.org)数据库对优化结果进行标准化,最终得到小柴胡汤有效活性成分的药物作用靶点集(集合 A)。
  
  1.3 构建肝癌的疾病靶点集
  
  利用 OMIM(https://www.omim.org)、Gene-Cards(https://www.genecards.org)、DisGeNET(http://www.disgenet.org)、TTD(https://db.idrblab.org/ttd) 4个数据库,收集已知的与肝癌相关的基因,经删重和剔除假阳性基因后,得到抗肝癌作用靶点集(集合 B),并利用 UniProt 数据库进行标准化。
  
  1.4 构建肝癌的差异表达基因集
  
  利用 GEO 数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)获取肝癌的相关基因测序和表达数据,利用 Bioconductor 进行预处理、合并、批次校正、探针注释、加权基因共表达网络分析(WGCNA)、构建共表达网络,得到肝癌的差异表达基因集(集合 C)。
  
  1.5 构建小柴胡汤抗肝癌靶点集
  
  将集合 B 和 C 合并、去重,得到肝癌直接作用靶点集(集合 D)。利用 STRING(https://string-db.org)数据库获取与集合 D 中的靶点具有直接联系的二级靶点(Combined_Score>0.9),构成肝癌间接作用靶点集(集合 E)。取集合 A 与集合 D、E 的交集,即 A∩(D∪E),作为最终的小柴胡汤抗肝癌靶点集(集合 F)。
  
  1.6 小柴胡汤中抗肝癌靶点的通路注释分析
  
  利用 STRING 数据库对小柴胡汤抗肝癌靶点集(集合 F)进行 GO 富集分析和通路注释分析,获得小柴胡汤抗肝癌的通路和调控机制。
  
  1.7 小柴胡汤抗肝癌的“成分-靶点-通路”无权网络构建
  
  对上述得到的小柴胡汤成分以及作用的靶点和通路,利用 Cytoscape 3.7.1 构建小柴胡汤抗肝癌的“成分-靶点-通路”无权重网络,并进行参数分析。
  
  1.8 小柴胡汤的“化合物-靶点-通路”加权网络构建
  
  本研究通过在传统的无向无权重网络基础上引入节点间的权重指标以提高分析结果的可靠性。节点间权重的获取方法如下,将对活性成分进行靶点预测过程中的相似度作为化合物-靶点间的权重,将 STRING 数据库分析中的 Combined_Score 作为靶点-靶点间的权重,将 RontoTools 的计算结果作为靶点-通路间的权重,从而定义节点强度参数 Ii、节点聚集强度参数 Gi、维恩系数 vi 以及节点重要度参数 Pi。
  
  其中,节点强度参数 Ii 为加权模式下节点的强度与其邻居节点强度的结合,如式〈1〉所示:
  
  Ii=f(si,sj) 〈1〉
  
  其中,Si为节点i的强度,Sj为邻居节点j的强度,计算方法如式〈2〉所示:
  
  其中,ki为节点i的度值,wij为节点与邻居节点的连边权值,α和β分别为度值及连接强度的权重系数,用来调整节点度值与连接强度的重要程度。
  
  节点聚集强度参数Gi将加权网络节点局部的聚集参数ci与节点强度Ii相结合,综合反映节点i与邻居之间的紧密程度,计算方法如式〈3〉所示:
  
  其中,ci为节点i加权后的集聚系数,计算方法如式〈4〉所示:
  
  ci=f(wij,wjk,wki) 〈4〉
  
  其中,wij和wki为节点与其邻居节点的连边权值,wjk为节点的邻居节点之间的连边权值。
  
  为不同来源的靶点节点设置相应的维恩系数,来自集合 A∩B∩C(集合X)的维恩系数为 1.0,来自集合A∩B(集合Y)的维恩系数为 0.9,来自集合A∩C(集合Z)的维恩系数为 0.8,来自集合A∩X的二级靶点的维恩系数为 0.5,来自集合A∩Y的二级靶点的维恩系数为 0.45,来自集合A∩Z的二级靶点的维恩系数为 0.4,同时符合多种集合条件时维恩系数取最高值。对于非靶点节点维恩系数取 1.0 不做调整。
  
  节点重要度参数Pi将节点强度、节点聚集强度、维恩系数相结合,计算方法如式〈5〉所示:
  
  Pi=f(Ii,Gi)×vi 〈5〉
  
  综合考虑每个节点的度值、邻居节点的信息、聚集程度以及靶点来源,最终得到具有每个节点重要度的加权网络,并分析得出核心靶点和核心通路。利用 Cytoscape 3.7.1 绘制加权分析后的“化合物-靶点-通路”核心网络,实现小柴胡汤抗肝癌的多成分、多靶点、多通路的协同作用机制的可视化分析。
  
  2 研究结果
  
  2.1 有效活性成分收集
  
  利用 TCMSP 数据库通过筛选条件(OB≥30%,DL≥0.18)检索得到有效活性成分 216 个(其中柴胡 17 个、黄芩 36 个、半夏 15 个、生姜 5 个、人参 22 个、大枣 29 个、甘草 92 个),去重后结果为 178 个。通过文献挖掘收集到被上述 OB、DL 条件剔除但被证实具有显著药理活性且对肿瘤细胞具有显著抑制作用的 4 个化合物,分别为柴胡皂苷 a[5]、柴胡皂苷 b[6]、柴胡皂苷 d[7]和人参皂苷 Rg3[8]。最终得到小柴胡汤的有效活性成分 182 个。
  
  2.2 小柴胡汤的药物作用靶点集构建
  
  利用 PubChem 数据库对 182 个有效活性成分进行基于配体结构特征的潜在靶点预测,利用 TCMKD 软件对每个有效活性成分的预测靶点通过“肘点法”进行筛选优化,最终得到小柴胡汤的 1241 个药物作用靶点集(集合 A)。
  
  2.3 已知抗肝癌作用靶点集构建
  
  利用 OMIM 数据库检索得到肝癌相关靶点 210 个,利用 GeneCards 数据库检索得到 186 个,利用 DisGeNET 数据库检索得到 615 个,利用 TTD 数据库检索得到 6 个。将上述 4 个检索结果合并、去重,最终得到已知具有抗肝癌作用的相关靶点 896 个(集合 B)。
  
  2.4 与肝癌高度相关的靶点集构建
  
  本研究选取同一平台 GPL570 的多张基因芯片进行联合分析。通过一体化预处理算法对原始的肝癌组织样本数据和癌旁正常组织样本数据进行预处理、合并、去除批间差异、注释探针,得到具有 23 494 个基因的表达矩阵,构建加权基因共表达网络。根据每个模块的模块显著性确定其与肝癌的相关度,如图 1 所示。本研究选择相关性最高的 red 和 blue 模块内的基因作为肝癌高度相关的靶点集,经标准化处理得到 1569 个差异显著基因(集合 C)。
  
  Figure 1 Heatmap of module-trait relationship
  
  2.5 小柴胡汤抗肝癌靶点集的建立
  
  将已知的具有抗肝癌作用的靶点集(集合 B)和与肝癌高度相关的靶点集(集合 C)合并、去重,得到肝癌直接作用靶点集(集合 D),共 2363 个靶点。利用 STRING 数据库,检索与肝癌直接作用靶点集(集合 D)有直接联系的二级靶点(Combined_Score>0.9),作为肝癌间接作用靶点集(集合 E)。将肝癌直接作用靶点集(集合 D)与肝癌间接作用靶点集(集合E)的并集(集合 D∪E)与小柴胡汤的药物作用靶点集(集合 A)取交集[A∩(D∪E)],得到小柴胡汤抗肝癌靶点集(集合 F),共计 907 个靶点。
  
  2.6 GO 富集分析和通路注释分析结果
  
  对小柴胡汤抗肝癌靶点集(集合 F)中的 907 个靶点通过 STRING 数据库进行 GO 功能富集分析和 KEGG 通路富集分析,并以 FDR<0.01作为筛选条件。按照 FDR 值进行升序排列,将排名前 15 个条目利用 R3.6.0 绘制高级气泡图,分析结果分别如图 2 和 3 所示。
  
  Figure 2 GO functional enrichment analysis bubble chart
  
  Figure 3 KEGG pathway enrichment analysis bubble chart
  
  小柴胡汤治疗肝癌的 GO 功能主要涉及催化活性、蛋白激酶活性、磷酸转移酶活性、激酶活性、小分子结合、药物结合、转移酶活性、阴离子结合、核苷酸结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性等。小柴胡汤治疗肝癌的KEGG通路主要涉及癌症通路、神经活性配体-受体相互作用、MAPK 信号通路、cAMP 信号通路、非酒精性脂肪肝、钙信号通路、PI3K-Akt 信号通路、癌症中的微核糖核酸、阿尔兹海默症、FoxO 信号通路、细胞凋亡、Ras 信号通路、病毒致癌等。
  
  2.7 小柴胡汤抗肝癌的“成分-靶点-通路”无权网络的构建结果
  
  利用 Cytoscape 3.7.1 软件构建普通无权重的小柴胡汤活性成分-靶点-通路网络模型,并进行拓扑网络分析。按照度值由大到小排序,得到 NFKB1、MAPK1、RELA、TDP1、ESR1 等 20 个排名靠前的关键靶点,pathways in cancer、metabolic pathways、neuroactive ligand-receptor interaction、MAPK signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway 等 30 个排名靠前的关键通路,如图 4 所示。其中节点为化合物(黄色矩形)、靶标(绿色三角形)和通路(紫色圆形),边为化合物-靶标对、靶标-靶标对、靶标-通路对。
  
  Figure 4 Ingredient-target-pathway network of Xiaochaihu decoction
  
  2.8 小柴胡汤“化合物-靶点-通路”加权网络的构建结果
  
  以靶点预测结果的相似度作为化合物-靶点间的权重,以 PPI 网络中的 Combined_Score 作为靶点-靶点间的权重,以 RontoTools 的结果作为靶点-通路间的权重,将无权的化合物-靶点-通路网络转换为有权网络。根据有权网络中节点的度值、节点间连线的权重、节点强度、节点聚集强度、维恩系数等参数,依次计算小柴胡汤“化合物-靶点-通路”加权网络中每个节点的重要度参数 Pi,Pi 值最大的 20 个关键靶点如表 1 所示。其中,节点的度值既包括 STRING 库 PPI 网络中靶点-靶点的连线又包括靶点-活性成分和靶点-通路的连线。
  
  综合考虑 KEGG 通路富集分析结果中的通路排名和加权网络中通路节点重要度参数排名,综合排名的前 30 个通路信息如表 2 所示,同时包含了通路富集分析结果的前 15 条通路和加权网络中节点重要度参数排名的前 15 条通路。
  
  利用 Cytoscape 3.7.1 以加权网络分析结果中重要度排名前 20 的关键靶点、综合排名前 30 的通路及相关活性成分为对象,绘制小柴胡汤的“成分-靶点-通路”核心网络图,结果如图 5 所示。其中节点为化合物(红色)、靶标(蓝色)和通路(绿色),边为化合物-靶标、靶标-靶标和靶标-通路对。结合图4和图5发现,在小柴胡汤的 182 个有效活性成分中有 158 个活性成分至少作用于一个关键靶点,这充分体现了中药小柴胡汤通过多成分-多靶点-多通路的相互作用来达到抗肝癌效果的协同作用机制特点。
  
  3 讨论
  
  本研究通过纳入药物靶点、疾病靶点、GEO 差异显著基因,并同时考虑小柴胡汤有效活性成分直接作用于肝癌靶点和间接作用于肝癌二级靶点的影响因素,较为客观地反映了中药多成分-多靶点-多通路协同作用的特点。通过给成分-靶点、靶点-靶点、靶点-通路间的联系赋以适当的权重,将传统的无权网络升级为加权网络并进行加权分析,挖掘出核心靶点和核心通路,更加真实地反映了小柴胡汤抗肝癌的作用机制。小柴胡汤抗肝癌的“化合物-靶点-通路”网络在加权前后关键靶点的对比结果如表 3 所示。
  
  加权前与加权后的对比结果显示,20 个关键靶点中有 8 个为加权前后所共有的,分别是:TP53、MAPK1、MAPK3、AKT1、NFKB1、RELA、ESR1、CASP3。
  
  TP53 是人体中重要的抑癌基因,TP53 基因的突变与肝癌的发生、发展密切相关[9]。马洪斌[10]等选择原发性肝癌组织和癌旁组织各 112 例份,检测 p53 蛋白表达,结果表明原发性肝癌组织 p53 蛋白相对表达量均明显高于癌旁组织(P<0.05),其表达变化与肿瘤进展和患者预后不良有关。
  
  MAPK 信号通路几乎存在于所有真核细胞中,其主要功能为将胞外信号经 Ras、Raf、MEK 及 MAPK 特异性磷酸化传递到胞内,并参与细胞增殖、分化和迁移。MAPK 信号通路在 50%~100%的肝癌中异常活化[11],并与肝癌的发生、侵袭、转移和肿瘤血管形成等过程密切相关[12]。冯子强等[13]研究表明,人参中的人参皂苷 Rh2 可通过激活 MAPK 通路来抑制肝癌 HepG2 细胞的迁移。MAPK1 是 MAPK 家族中的一员,MAPK1 调控异常与肿瘤发生发展密切相关。李晓楠等[14]研究发现,黄芩中的汉黄芩素可以直接抑制肝癌细胞 SMMC-7721 生长,减少肝癌细胞的迁移率,减缓肝癌细胞生长融合时间。张锐等[15]研究表明,在体内,20(S)-原人参二醇可抑制肝癌 SMMC-7721 细胞裸鼠异种移植瘤的生长;在体外,20(S)-原人参二醇对肝癌细胞的增殖具有明显的抑制及诱导其凋亡的作用,且呈时间和剂量依赖性。
  
  PI3K-Akt 信号传导途径可被多种类型的细胞刺激或毒性刺激所激活,并调节转录、翻译、增殖、生长和存活等基本细胞功能。该途径一旦激活,Akt 可重新定位到细胞质、细胞核或细胞内的其它部位,磷酸化大量的底物蛋白,进而调节细胞的功能,异常活化的 Akt 会导致肿瘤发生。孙佳等[16]研究表明,槲皮素能诱导 SMMC-7721 肝癌细胞凋亡,其机制可能是下调 PI3K-Akt 通路,增强凋亡因子与降低抗凋亡蛋白的活性,促进肝癌细胞的凋亡。Zhu 等[17]研究表明,山柰酚可通过下调 miR-21 和灭活 PI3K-Akt 信号通路来抑制 HepG2 肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。MAPK 信号通路与 PI3K-Akt 信号通路部分如图 6 所示。
  
  加权前与加权后的结果对比显示,GAPDH、HRAS、EGFR、TNF、MYC、BRCA1、STAT3、JUN、PTGS2、F2、MAPK8、DRD2 为加权后特有的关键靶点。
  
  JUN(c-Jun)蛋白是 AP-1 复合物中的转录因子,目前已证实 c-Jun 蛋白高表达与多种恶性肿瘤的发生和预后密切相关[18]。杨跃武等[19]研究表明,c-Jun 蛋白可能在肝癌的发生、发展中起重要作用,并影响肝癌患者的术后生存。
  
  PTGS2 即为环氧合酶 COX2 的别称,是前列腺素合成的主要限速酶,受到炎症、肿瘤等外界刺激时发生高表达。已有研究表明在未受乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染的肝癌患者中,初次治疗后,服用 COX2 抑制剂美洛昔康可能会抑制肝癌的复发[20]。
  
  结合文献可以看出,加权前后所共有的 8 个关键靶点中有 3 个靶点(TP53、AKT1、MAPK1)已有文献证实。加权后,TP53 排名由加权前的第 6 位上升到第 2 位,AKT1 由加权前的第 7 位上升到第 4 位,MAPK1 排名略有下降,由加权前的第 2 位下降到第 5 位。加权后所特有的 12 个关键靶点中,2 个靶点(JUN、PTGS2)已有文献证实其在肝癌的发生、发展中的重要作用。可以看出,加权网络分析后,已有文献证实的关键靶点排名总体上升,个数增加。可见加权网络对于关键靶点的筛选具有实际意义。
  
  通过建立小柴胡汤活性成分-靶点-通路网络并进行网络拓扑分析发现,小柴胡汤中的黄连碱、黄芩素、胡萝卜甙等活性成分 Pi 值较高,在网络中属于重要活性成分。小柴胡汤中的黄连碱作用于 FGFR1(RTK 家族,图 6 中①)、KDR(RTK 家族,图 6 中①)、Raf1(Raf 家族,图 6 中②)、MAP2K1(MEK 家族,图 6 中③)、MAPK1(ERK 家族,图 6 中④)、Akt1(Akt 家族,图 6 中⑤),推测黄连碱可能通过抑制上述靶点活性起到抗肝癌作用;小柴胡汤中的黄芩素作用于 FGFR1、MAPK1、Akt1 等靶点,推测黄芩素可能通过作用于上述靶点达到抗肝癌效果;胡萝卜苷作用于 MAPK1 等靶点,推测其可能通过抑制 MAPK1、Akt1 活性从而诱导肝癌细胞凋亡。
  
  综上所述,本研究通过 TCMSP、PubChem、STRING、GEO 等数据库和 TCMKD 1.0、Cytoscape 3.7.1 等软件分析预测了小柴胡汤抗肝癌的靶点和通路,并通过构建加权网络更加精确地揭示其抗肝癌的作用机制。研究结果与现有抗肝癌靶蛋白的药理作用研究一致。小柴胡汤通过调控 20 多个重要靶点,整体协同发挥抑制肿瘤生长、促使肿瘤细胞凋亡的作用,充分体现了中药多成分-多靶点-多通路协同作用的特点,为进一步深入研究小柴胡汤抗肝癌的作用机制提供了参考。
  
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