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基于网络药理学五苓散改善糖尿病肾病作用机制研究

更新时间:2021-01-05 09:03点击:

  王诗怡 佟奕霖 杨宇峰 石岩
  
  辽宁中医药大学
  
  摘    要:
  
  目的 基于网络药理学方法探讨五苓散改善糖尿病肾病的作用机制。方法 借助TCMSP中药系统药理学分析平台收集五苓散全方5味中药的化合物及有效靶点;利用GeneCards数据库筛选疾病靶点,取交集并绘制维恩图;运用Cytoscape软件构建疾病-药物-活性成分-关键靶点网络;从STRING数据库构建靶点蛋白互作(PPI)网络;进行基因功能GO分析和KEGG通路富集分析。结果 获得50个活性化合物,药物靶点29个,疾病靶点2572个,交集靶点21个。PPI网络关键靶点包括CASP3、ESR1、RELA、AR等。GO功能分析主要糖尿病肾病(DN)结合转录激活活性RNA聚合酶II特异性、类固醇激素受体、类固醇结合、核受体活性、转录因子活性直接配体调节的序列特异性DNA结合等相关。通过分析富集的KEGG通路可以发现,糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、乙型肝炎、细胞凋亡、甲型流感可能是本方发挥作用的主要信号通路。结论 本研究初步预判五苓散可能通过靶向作用关键蛋白和重要通路达到改善糖尿病肾病的效用,有望对中药复方防治糖尿病肾病提供新的证据和研究思路。
  
  关键词:
  
  五苓散 糖尿病肾病 消渴 网络药理学
  
  随着人们生活水平的日益提高,我国糖尿病患者人数已位居世界第一[1]。随着糖尿病(diabetes mellitus,DM)发病率的上升,糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)的发病率也在随之上升[2]。糖尿病肾病是糖尿病常见的慢性微血管并发症之一,是引起终末期肾病(endstagerenaldisease,ESRD)的最常见原因。该病防治率低,预后差,临床除了降糖、降压、抗凝、控制血脂等手段以外[3],仍缺乏专门治疗糖尿病肾病的方法,严重影响了患者的生存质量。
  
  五苓散首见于“医圣”张仲景所著的《伤寒杂病论》。该方由猪苓、茯苓、泽泻、白术、桂枝五味药组成,具有利水渗湿、温阳化气的功效[4]。近年来,五苓散在治疗糖尿病肾病方面取得了一定的进展[5-7],但其治疗糖尿病肾病的具体机制尚少有报道。
  
  本研究基于网络药理学的复杂网络与可视化技术,结合中药治疗疾病具有多靶点、多途径与多靶点协同作用的特点,对五苓散治疗糖尿病肾病的主要活性成分、作用靶点、作用通路等方面进行探讨,旨在为研究五苓散治疗糖尿病肾病的作用机制提供研究思路,从而为其在临床上的广泛应用提供依据。
  
  1 方法
  
  1.1 化学成分及作用靶点构建
  
  通过中药系统药理学数据库(TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索五苓散(猪苓、茯苓、泽泻、白术、桂枝)中各种中药的所有化学成分。以口服生物利用度(OB)和类药性(DL)评价成分的体内过程,选择OB≥30%和DL≥0.18作为筛选条件筛选活性成分,筛选出猪苓、茯苓、泽泻、白术、桂枝中的化合物及其对应靶点,然后借助Uniprot数据库(http://www.uniprot.org/)将所得靶点转换成对应的基因。
  
  1.2 DN相关靶点获取
  
  以“diabetic nephropathy”为关键词进行检索,在Gene Cards数据库(https://www.genecards.org/)中搜索糖尿病肾病的相关靶点,将检索出的靶点进行整合,去掉重复值,构建糖尿病肾病相关靶点数据库。
  
  1.3“疾病-药物-活性成分-关键靶点”网络的构建和分析
  
  利用R语言将五苓散的活性成分所对应的靶点基因和糖尿病肾病相关的靶点基因进行匹配,获得两者的交集基因即为五苓散-糖尿病肾病的关键靶点,并绘制Venn图。
  
  采用Cytoscape软件(Version3.6.0)构建疾病-药物-活性成分-关键靶点关系网络。通过构建网络探究五苓散改善糖尿病肾病的作用机制。
  
  1.4 PPI网络的构建
  
  将药物-疾病关键靶点导入STRING数据库平台(https://STRING-db.org/)进行蛋白质与蛋白质相互作用(PPI)分析,限定研究物种为“人”(homo sapiens),最低相互作用评分设置为中等置信度[medium confidence(0.400)],隐藏网络中无联系的节点,其余参数保持默认设置,得到五苓散作用于糖尿病肾病的PPI网络。其中浅蓝色的线代表从数据库中的来的蛋白间作用,紫色线代表经过实验验证的蛋白间作用。
  
  1.5 关键靶点基因本体(gene ontology,GO)富集分析和基因相互作用(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析
  
  为了说明中药化合物对应的预测靶点在基因功能和通路中的作用,进行GO富集分析和KEGG通路分析。利用Bioconductor平台(http://bioconductor.org/bioc Lite.R)和R语言对获得的关键靶点基因进行分析,导出GO富集及分析表格,并绘制barplot柱状图和dotplot点图。KEGG通路富集分析可导出KEGG富集分析表格,KEGG通路图,亦绘制barplot柱状图和dotplot点图。
  
  2 结果
  
  2.1 五苓散活性成分的筛选
  
  通过TCMSP平台数据库检索五苓散(猪苓、茯苓、泽泻、白术、桂枝)中所有化学成分,共搜集了386个化合物,其中猪苓31个、茯苓34个、泽泻46个、白术55个、桂枝220个。
  
  通过筛选阈值分别为OB≥30%,DL≥0.18的化合物,386个化合物分子中有50个符合条件。详见表1。
  
  表1 五苓散活性成分信息
  
  表1 五苓散活性成分信息
  
  2.2 五苓散成分改善糖尿病肾病的潜在作用靶点预测
  
  利用TCMSP平台筛选活性成分对应的潜在作用靶点,逐一对应靶点发现24个化合物无对应靶点,即五苓散有效化合物为26个,得到猪苓潜在活性成分的作用靶点10个,茯苓潜在活性成分的作用靶点15个,白术潜在活性成分的作用靶点11个,泽泻潜在活性成分的作用靶点9个,桂枝潜在活性成分的作用靶点31个,去除重复靶点后,共计29个。
  
  在Gene Cards数据库中,以“diabetic nephropathy”为关键词进行检索,将检索出的靶点进行整合,去掉重复值,共计2572个。
  
  利用R语言绘制韦恩图,结果见图1,获得共同靶点21个,分别为NR3C2、PGR、AR、CHRM2、ADH1B、PTGS1、ACHE、NCOA1、NR3C1、BCL2、CASP9、CASP3、CASP8、PRKCA、PON1、ESR1、AKR1B1、RELA、ICAM1、MTTP、APOB。
  
  2.3 疾病-药物-活性成分-关键靶点网络的构建与分析
  
  借助Cytoscape软件对疾病-药物-活性成分-关键靶点关系数据进行网络构建,得到了一个包含53个点和102条连线的网络,黄色节点代表疾病,橙色节点代表疾病与药物活性成分的关键靶点;蓝色节点为五苓散中药物,紫色节点为五苓散中与关键靶点相关的活性成分,见图2。以度值(degree值)作为拓扑分析的主要参考依据,排名前5位的活性成分是β-谷甾醇(beta-sitosterol)、常春藤皂苷元(hederagenin)、3β-乙酰氧基苍术酮(3β-acetoxyatractylone)、谷甾醇(sitosterol)、二氢槲皮素(taxifolin),详见表2。这些度值较高的化合物可能是五苓散发挥治疗糖尿病肾病的关键化合物。这体现了中药方剂多成分、多靶点的作用机制。
  
  图1 五苓散与DN共同靶点基因
  
  图2 疾病-药物-活性成分-关键靶点网络
  
  表2 药物-活性成分-作用靶点相互作用网络中活性成分的拓扑参数
  
  2.4 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络的构建及分析
  
  为了进一步研究五苓散治疗糖尿病肾病的作用机制,本研究利用STRING数据库平台(https://STRING-db.org/)来预测蛋白相互作用关系并绘制蛋白关系网络图。将五苓散-糖尿病肾病的21个关键靶点导入STRING数据库,研究物种选择为人类(homo sapiens),最低相互作用评分设置为中等置信度[medium confidence(0.400)],隐藏网络中无联系的节点,其余参数保持默认设置,得到五苓散作用于糖尿病肾病的PPI网络,见图3。如图3所示,五苓散靶蛋白PPI网络有20个节点(1个靶蛋白未参与蛋白的相互作用)、50条相互作用连线,其中浅蓝色的线代表从数据库中的来的蛋白间作用,紫色线代表经过实验验证的蛋白间作用。根据网络间连线节点数目排列,得到PPI网络中核心基因,见图4。
  
  图3 蛋白关系网络图
  
  图4 PPI网络核心基因
  
  2.5 GO富集分析
  
  GO富集分析结果显示,五苓散-糖尿病肾病的21个潜在关键靶点基因影响了25个生物学过程。GO富集排名靠前的生物学功能主要为DNA结合转录激活活性RNA聚合酶II特异性(5个靶点:PGR、AR、NR3C1、ESR1、RELA)、类固醇激素受体(5个靶点:NR3C2、PGR、AR、NR3C1、ESR1)、类固醇结合(5个靶点:NR3C2、PGR、AR、NR3C1、ESR1)、核受体活性(4个靶点:PGR、AR、NR3C1、ESR1)、转录因子活性直接配体调节的序列特异性DNA结合(4个靶点:PGR、AR、NR3C1、ESR1)等,见图5~图6。
  
  图5 GO富集分析barplot图
  
  图6 GO富集分析dotplot图
  
  2.6 KEGG富集通路分析
  
  对五苓散治疗糖尿病肾病的21个关键靶点基因进行KEGG通路富集分析,分析结果见图7~图8。关键靶点主要富集于糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、乙型肝炎、细胞凋亡、甲型流感、人类免疫缺陷病毒1感染、EB病毒感染、癌症相关通路等,提示五苓散通过作用多条通路来发挥治疗糖尿病肾病的作用。
  
  图7 KEGG通路富集分析barplot图
  
  3 讨论
  
  糖尿病肾病是糖尿病的严重并发症之一。该病发生的原因主要有高血糖、炎症、血管内皮功能受损、氧化应激、糖基化产物、血液流变学改变等[8]。糖尿病肾病在中医学中,归属于“肾消”、消渴病合并“水肿”“肾劳”“关格”的范畴[9]。《圣济总录》云:“消渴病久,肾气受伤,肾主水,肾气虚衰,气化失常,开阖不利,能为水肿。”《五苓散》出自《伤寒杂病论》,为太阳病表里双解法代表方之一,具有利水渗湿、温阳化气的功效。临床上,五苓散治疗糖尿病肾病取得了一定的进展,但其作用机制尚不明确,故本研究基于网络药理学的方法,利用相应的数据库和软件,构建了网络并对靶点进行了通路富集分析,初步挖掘和分析了五苓散治疗糖尿病肾病可能的作用机制。
  
  图8 KEGG通路富集分析dotplot图
  
  本研究结果显示,五苓散发挥治疗糖尿病肾病的关键化合物有β-谷甾醇(beta-sitosterol)、常春藤皂苷元(hederagenin)、3β-乙酰氧基苍术酮(3β-acetoxyatractylone)、二氢槲皮素(taxifolin)等。研究表明,β-谷甾醇具有降血脂、抗炎、抗肿瘤的作用[10],并且能够干扰多种细胞信号通路,包括细胞周期、凋亡、增殖、存活、血管生成、转移和炎症等[11]。常春藤皂苷元具有抗糖尿病、抗肿瘤、抗抑郁、抗菌抗炎等多种药理作用[12]。张显涛等[13]研究发现常春藤皂苷元对α-糖苷酶具有显著的抑制活性。二氢槲皮素有很强的抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎抗过敏等作用[14]。王佳奇等[15]研究发现二氢槲皮素能显著抑制脂多糖诱导细胞对一氧化氮(NO)、前列腺素2(PGE2)的释放,均能有效降低白介素-1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF-α)基因的表达,并且二氢槲皮素均具有良好的体外抗炎作用。
  
  通过STRING数据库蛋白质-蛋白质相互作用网络分析,结果提示五苓散-糖尿病肾病核心基因涉及CASP3、ESR1、RELA、AR等。CASP3编码的蛋白质是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶。该基因是细胞凋亡的主要执行者,在细胞凋亡的执行阶段通过特异性地裂解一系列底物起着关键作用[16]。ESR属于一类配体活化的转录调节因子,属核受体超家族成员[17],有研究表明,ESR1基因多态性与乙型肝炎病毒(HBV)持续感染显著相关[18]。RELA全称RELA原癌基因,又称NF-κB亚基。NF-κB是一种参与多种生物学过程的普遍存在的转录因子。该因子与许多生物过程(例如炎症、免疫、细胞分化、凋亡等)有关[19]。
  
  进一步进行GO功能富集分析,结果显示五苓散治疗糖尿病肾病涉及的多个生物学过程,主要集中于DNA结合转录激活活性RNA聚合酶II特异性、类固醇激素受体、类固醇结合、核受体活性、转录因子活性直接配体调节的序列特异性DNA结合等,提示五苓散治疗糖尿病肾病可以通过作用多个靶点来发挥作用。KEGG富集通路分析发现关键靶点主要富集于糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、乙型肝炎、细胞凋亡、甲型流感、癌症相关通路等。研究表明,AGEs-RAGE信号通路能够激活NF-κB;刺激产生血管内皮生长因子(VEGF);刺激转化生长因子-β1(TGF-β1)的产生;诱导单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)表达增强;激活还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶[20]。PI3K-Akt信号通路是调控糖尿病肾病发生发展的一条重要的信号传导途径[21]。张翠香等[22]的研究结果显示,在糖尿病肾病模型组的大鼠肾组织中,PI3K和Akt均被激活。乙肝病毒通过损伤肝功能可导致肝脏糖代谢异常[23],从而加速糖尿病肾病的发生发展。在糖尿病肾病中,足细胞不仅会足突增宽,而且细胞数量会同时减少。细胞凋亡是糖尿病肾病足细胞损伤表型改变的主要特征之一[24]。
  
  4 小结
  
  本研究为进一步的实验研究和临床应用提供思路和参考依据,也为中药复方作用机制提供了新方向。但是,本研究依旧存在一些不足需要解决,如网络药理学是以数据研究为基础,数据搜集的全面与否、活性成分筛选标准和靶标预测方法等都会影响研究结果的准确性。此外,本研究尚未考虑药物剂量及煎服方法对治疗结果的影响,因此整合药理学预测分析的结果仍需通过进一步实验去验证本研究结果。
  
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