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基于网络药理学探究补肾活血汤治疗股骨头坏死的作用机制

更新时间:2021-01-14 08:17点击:

夏天卫 周国威 刘金柱 田林 邱越 沈计荣
南京中医药大学附属医院
 
摘    要:
目的:采用网络药理学方法筛选补肾活血汤治疗股骨头坏死的作用靶点,明确其作用机制。方法:通过中药系统药理数据库(TCMSP)检索补肾活血汤11味中药的所有化学成分并筛选作用靶点;通过GeneCards、CTD、OMIM等数据库查询股骨头坏死的疾病靶点;利用R语言筛选药物和疾病的核心靶点,进而构建靶点的相互作用网络图;基于DAVID数据库对靶点进行GO通路富集分析和KEGG通路富集分析。结果:以口服利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18作为化合物分子筛选条件,共筛选出补肾活血汤162个活性成分和1244个相应靶点蛋白,其中与股骨头坏死261个疾病相关靶点相交的核心靶点为21个。GO通路富集分析共得到826条结果,其中生物过程741条,细胞组成20条,分子功能65条。KEGG通路富集分析共得到23条通路,经进一步筛选,得到在治疗股骨头坏死中发挥潜在作用的3条通路,分别为癌症蛋白多糖通路、甲状腺激素信号通路、癌症相关通路。结论:补肾活血汤治疗股骨头坏死具有多成分、多靶点、整体调节的特点,其作用机制可能是通过抑制炎症、氧化应激等促进成骨。
 
关键词:
网络药理学 补肾活血汤 股骨头坏死 槲皮素 木犀草素 β-谷甾醇 成骨 骨痹
股骨头坏死(ONFH)是由多种病因引起股骨头血液供应不良,导致骨的微结构改变,进而造成髋关节功能障碍的一种疾病[1]。据调查,全世界约有ONFH患者2000多万例,我国ONFH患病人数约为812万[2-3]。本病系骨科常见的难治性疾病,现代医学尚无行之有效的保髋手段。中药治疗疾病具有多成分、多靶点、系统调控的优势,在本病的治疗中应用较广[4-6]。ONFH属于中医学中骨痹、骨痿、骨蚀范畴,多数医家认为ONFH属本虚标实证,病机以肝肾亏虚为本,气滞血瘀为标,治疗当补益肝肾、活血化瘀。
 
补肾活血汤源自骨伤科经典著作《伤科大成》,该方以熟地黄、山茱萸、菟丝子、枸杞子滋补肝肾之阴,杜仲、肉苁蓉、补骨脂温补肝肾之阳,独活祛风散寒,当归、没药、红花补血活血。全方诸药共奏补益肝肾、强壮筋骨、化瘀止痛功效,是治疗伤科肾虚血瘀证的名方[6-8]。江苏省中医院骨伤科的补肾活血汤由《伤科大成》中的补肾活血汤加减而成,用于治疗ONFH,取得较好疗效[9-10]。但迄今为止,补肾活血汤治疗ONFH的机制尚未完全清晰。
 
网络药理学摆脱了传统药理学“一个靶点,一种疾病,一个药物”的研究模式[11],从整体角度探索药物与疾病的关联性,以阐释单药或复方“多组分、多靶点、多途径”的药理机制,这与中医整体观念、辨证论治的治疗理念不谋而合[12-13]。基于网络药理学探讨单药或复方治疗疾病的作用机制已成为近年来的热点之一,其中,基于网络药理学的中药药理机制研究、新药发现、药物重新定位、不良反应研究等已取得较大进展[14-17]。本研究采用网络药理学方法,对补肾活血汤多成分、多靶点与ONFH的复杂网状关系进行研究,旨在进一步探索补肾活血汤治疗ONFH的作用机制并揭示其科学内涵。
 
1 方法
1.1 补肾活血汤化学成分的检索
基于中药系统药理学数据库与分析平台(TCM-SP),以“熟地黄”“山茱萸”“菟丝子”“枸杞子”“杜仲”“肉苁蓉”“补骨脂”“独活”“当归”“没药”“红花”为检索词,检索补肾活血汤11味中药的全部化学成分。
 
1.2 活性化合物的筛选及潜在靶点的搜集
以口服利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18作为活性化合物筛选条件,提取出TCMSP中具有较高活性的化合物,并在TCMSP平台搜集与候选化合物相关的潜在靶点。
 
1.3 疾病靶点的确定
通过GeneCards数据库搜集到ONFH的疾病相关靶点235个、CTD数据库搜集到ONFH的疾病相关靶点0个(Reference 25个)、OMIM数据库搜集到ONFH的疾病相关靶点51个,去除重复靶点后得到261个靶点。
 
1.4 核心靶点的筛选及蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络的构建
通过R语言VennDiagram数据包筛选复方潜在靶点和疾病相关靶点的交集,生成韦恩图,并将靶点数据上传至String数据库中构建PPI图,并对靶点进一步筛选。
 
1.5 化合物-靶点-疾病网络的构建
将筛选后的核心靶点上传至Cytoscape 3.6.1软件生成化合物-靶点-疾病网络图,以展现复方在系统水平上对疾病的作用。
 
1.6 GO通路富集分析和KEGG通路富集分析
为说明中药化合物的靶点蛋白在基因功能中的作用,本研究利用DAVID数据库对核心靶点进行GO通路富集分析和KEGG通路富集分析,并运用GraphPad Prism软件对富集分析结果进行可视化处理,以体现补肾活血汤治疗ONFH的主要作用通路。
 
2 结果
2.1 药物活性化合物及靶点筛选结果
通过TCMSP共搜集到补肾活血汤化合物1430个,其中熟地黄76个,山茱萸226个,菟丝子29个,枸杞子188个,杜仲147个,肉苁蓉75个,独活99个,当归125个,没药276个,红花189个。以OB≥30%、DL≥0.18为筛选条件,共筛选出190个具有较高活性的化合物,其中熟地黄2个,山茱萸20个,菟丝子11个,枸杞子45个,杜仲28个,肉苁蓉6个,独活9个,当归2个,没药45个,红花22个。去除重复后,共得到162个可作为候选化合物的活性成分。另外,在TCMSP平台上搜集到候选化合物的1244个相应靶点蛋白。
 
2.2 核心基因筛选及PPI网络图构建结果
利用R语言VennDiagram数据包筛选出复方潜在靶点和疾病相关靶点的交集,生成韦恩图,见图1。图中蓝色代表疾病靶点,红色代表补肾活血汤化合物作用靶点,二者取交集,得到22个共同靶点。将这些靶点上传至String软件构建PPI网络,见图2。在PPI网络图中,共有22个节点,117条边,平均节点度为10.6,网络节点代表靶点蛋白,线条代表蛋白质之间的联系。去除1个孤立节点后,得到补肾活血汤治疗ONFH的21个核心靶点,分别为:ESR1,NCOA2,HTR3A,NR3C1,PPARG,GSK3B,VEGFA,CASP3,HIF1A,CYP3A4,ALB,CTNNB1,CCND1,IL6,PCNA,PON1,NOS3,SREBF1,CD44,RUNX2,IGFBP3。
 
2.3 化合物-靶点-疾病网络构建结果
将补肾活血汤的162个化合物和补肾活血汤、股骨头坏死的22个共同靶点上传至Cytoscape3.6.1软件中,构建“化合物-靶点-疾病相互作用网络图”,见图3。图中共包含95个节点(22个靶点节点,73个化合物节点)和1407条边,其中黄色椭圆形代表化合物,黄色三角形代表靶点。
 
162个化合物中,有90个化合物与核心靶点无关联,其中作用靶点>10个的化合物有1个(槲皮素),作用靶点数排名前3位的化合物为:MOL000098槲皮素,MOL000006木犀草素,MOL000358β-谷甾醇。22个靶点中,有20个靶点与3个以上化合物分子相连接,度值最高的前3位为核受体共激活因子-2(NCOA2)、过氧化物酶体增生激活受体γ(PPARG)、雌激素受体α(ESR1)。
图1 补肾活血汤和股骨头坏死共同靶点筛选韦恩图 
图2 核心靶点蛋白质-蛋白质相互作用网络图 
2.4 GO通路富集分析结果
利用DAVID数据库对22个靶点进行GO通路富集分析,共得到826条结果。将P≤0.05设为生物过程(BP)、细胞组成(CC)、分子功能(MF)3组的基本筛选条件,筛选出每组排名前10位的GO通路富集结果。在BP分析结果中,主要包括化学刺激反应通路、分子功能的正调控通路、有机物反应通路等,见图4。在CC分析结果中,主要涉及核质、转录因子复合体、RNA聚合酶II转录因子复合体等,见图5。在MF分析结果中,主要包括大分子复合物结合通路、转录因子结合通路、核激素受体结合通路等,见图6。
图5 补肾活血汤活性成分-潜在靶点GO通路富集的细胞组成分析结果 
图4 补肾活血汤活性成分-潜在靶点GO通路富集的生物过程分析结果
图3 化合物-靶点-疾病相互作用网络
图6 补肾活血汤活性成分-潜在靶点GO通路富集的分子功能分析结果
2.5 KEGG通路富集分析结果
利用DAVID数据库对筛选出的靶点进行KEGG通路富集分析,共得到23条信号通路,以P<0.05、错误发现率(FDR)<0.05为条件进行筛选,得到3条信号通路,分别为癌症蛋白多糖通路、甲状腺激素信号通路、癌症相关通路,提示补肾活血汤治疗ONFH的作用机制可能与这3条信号通路相关。见图7。
图7 补肾活血汤活性成分-潜在靶点的KEGG通路富集分析结果
3 讨论
3.1 补肾活血汤治疗ONFH的有效成分可能是槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇
本研究分析了补肾活血汤中11味中药(熟地黄、山茱萸、菟丝子、枸杞子、杜仲、肉苁蓉、补骨脂、当归、没药、红花)的有效成分,构建了化合物-靶点-疾病网络,网络中的关键药物成分为MOL000098槲皮素,MOL000006木犀草素,MOL000358β-谷甾醇。槲皮素是菟丝子的有效成分,β-谷甾醇是山茱萸的有效成分,木犀草素则是红花的有效成分。
 
槲皮素是一种天然多酚类化合物,存在于诸多中药材中。药理研究表明,槲皮素具有抗炎、抗氧化、调节免疫作用,可有效减少免疫细胞炎症因子的分泌,其作用机制可能与抑制核因子-κB(NF-κB)、蛋白激酶B(PKB)的磷酸化有关[18-20]。程丽艳等[21]发现,槲皮素能通过抑制p38 MAPK蛋白表达,降低白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、内皮中性粒细胞激活肽-78(ENA-78)等细胞因子的表达,达到抗炎目的。槲皮素可通过使Toll样受体(TLR)沉默,从而抑制内毒素(LPS)诱导膜表面黏附分子(CD80,CD86,MHC I/II)和炎症因子的表达,达到抗炎作用[22]。HUANG等[23]研究发现槲皮素可阻断树突状细胞骨架的重组,进而阻止其抗原提呈作用,抑制T淋巴细胞的活化。因槲皮素不良反应较小,故其具有较好的药用前景,并且有临床研究表明,槲皮素对疼痛类疾病的缓解具有良好作用[24]。
 
木犀草素是具有抗炎和调节免疫作用的黄酮类化合物,并具有不良反应少、多效调节的特点[25]。李惠香等[26]研究发现,木犀草素对脂多糖诱导的小鼠RAW 264.7细胞炎症介质和炎症蛋白的高表达具有抑制作用。王书侠等[27]进一步阐明,木犀草素可能通过降低磷酸化的信号传导及转录激活因子-3(p-STAT3)水平、提高磷酸化的信号传导及转录激活因子-6(p-STAT6)水平来调节RAW 264.7细胞的经典活化(M1型)/选择性活化(M2型),从而发挥抗炎作用。Yan等[28]开展的研究表明,木犀草素可降低小鼠巨噬细胞的吞噬功能及体内溶菌酶活力,从而发挥一定的免疫调节作用。赵长祺等[29]通过实验发现,木犀草素可抑制T淋巴细胞的增殖,且高浓度的木犀草素可激活线粒体凋亡通路,进而诱导细胞凋亡。
 
β-谷甾醇具有抗氧化、抗炎、降低胆固醇等功效。Ambavade等[30]发现β-谷甾醇可增加超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性,降低过氧化氢酶活性。Gupta等[31]认为β-谷甾醇具有抗炎作用,其抗炎机制是通过下丘脑-垂体-肾上腺素轴系统发生的。Valerio等[32]通过研究发现β-谷甾醇可提高抗炎因子白细胞介素(IL-10)的活性,降低趋化因子和促炎因子活性,同时增强酪氨酸磷酸酶(SHP-1)活性,抑制NF-κB活化。另有多项研究表明,β-谷甾醇的抗炎作用机制与减少NO合成,抑制巨噬细胞白细胞介素-6(IL-6)活性,减少白细胞介素-1(IL-1)、TNF-α等炎症因子分泌有关[33-35]。
 
目前认为,激素、乙醇等诱发的炎症、氧化应激等病理反应,可造成股骨头内血管损伤、成骨不足,导致股骨头坏死[36-38]。炎症反应导致TLR4/NF-κB的激活,可以抑制成骨分化,导致大鼠股骨头坏死;还可以促进破骨细胞增殖、活化[39-40]。槲皮素、木犀草素具有抗炎作用,可抑制NF-κB等信号通路,促进成骨、抑制破骨。高脂血症、氧化应激可以造成血管内皮的损伤[41]。β-谷甾醇具有抗氧化、降血脂功能,可减少股骨头相关血管内皮的损伤。
 
3.2 补肾活血汤治疗ONFH的作用靶点可能是NCOA2、PPARG、ESR1
化合物-靶点-疾病网络中的20个靶点相互作用配体数目最多的前3位分别是NCOA2、PPARG、ESR1。PPARG是Ⅱ型核激素受体超家族的一员,近年来研究发现其对骨髓基质干细胞(BMSCs)分化方向具有重要调控作用,可诱导成脂分化,抑制成骨分化[42]。激素能明显上调鼠、兔、人BMSCs内PPARγ基因表达,造成股骨头内大量脂肪堆积,髓腔内压力增高,血供减少,导致缺血,最终诱发激素性股骨头缺血坏死。目前,关于NCOA2、PPARG、ESR1基因与ONFH之间关系的报道总体较少,补肾活血汤通过调控NCOA2、PPARG、ESR1等基因的转录及表达治疗ONFH的相关研究报道则更少,因此,本研究的结果尚待深入探讨。
 
3.3 补肾活血汤复方可能作用于多条通路
为明确补肾活血汤治疗ONFH作用靶点在基因功能、信号通路等方面的作用,本研究通过DAVID数据库和GraphPad Prism软件进行了GO通路富集及前10条通路的可视化处理,发现补肾活血汤主要能调节细胞对化学刺激反应通路、分子功能的正调控通路、有机物反应通路等。在KEGG通路富集结果中,大多数靶点富集到癌症相关通路上。目前补肾活血汤治疗股骨头坏死的机制尚不清晰,可结合上述研究结果进一步探索。
 
综上,本研究应用网络药理学方法,初步探究了补肾活血汤治疗ONFH多成分、多靶点、多通路的复杂机制,为后续研究提供了思路与依据。但由于条件限制,本研究也存在一定不足,如未融合中药方剂“君臣佐使”理念,未涉及剂量关系对复方干预疾病的影响等。相信随着技术的发展,以及网络药理学和系统生物学研究的深入与完善,中医药基础理论的科学性将得到更充足的论证。
 
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