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丹参葛根药对治疗2型糖尿病的药效学研究

更新时间:2021-01-14 08:24点击:

张娜 李雪嘉 江晓红 吴佳萍 吴立蓉
广东药科大学药学院 广东药科大学广东省生物活性药物研究重点实验室 广东药科大学生命科学与生物制药学院
摘    要:
目的 研究丹参葛根药对对2型糖尿病大鼠的降糖作用。方法 采用高糖高脂饲料喂养结合小剂量链脲佐菌素(STZ)注射诱导2型糖尿病大鼠模型。造模成功后,将大鼠随机分为模型组(M组)、二甲双胍组(Y组)、丹参葛根低剂量组(L组)、丹参葛根高剂量组(H组),并设正常对照组(Z组)。灌胃(ig)给药4周,每周测量大鼠体质量和空腹血糖(FBG),观察高、低剂量丹参葛根药对对2型糖尿病大鼠药效学指标的影响作用,包括一般状态观察、空腹血糖水平及各组大鼠血脂指标、肝肾功能指标,并对大鼠肾脏以及胰腺组织HE染色后观察组织学变化。结果 丹参葛根药对高、低剂量均能显著降低2型糖尿病大鼠的血糖水平以及血清碱性磷酸酶(ALP)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL-D)、肌酐(Cr)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)的含量,与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05),且大鼠肾脏和胰腺组织的病理状况明显改善。结论 丹参葛根药对能够有效降低2型糖尿病大鼠的空腹血糖、血脂及肝肾功能指标,有效改善肾脏、胰脏病变。
 
关键词:
丹参葛根药对 2型糖尿病 降血糖 血脂指标 HE染色
糖尿病 (diabetes mellitus,DM) 是一类由于遗传和环境作用,导致胰岛素分泌缺陷以及靶细胞对胰岛素敏感性降低,从而引起的以血糖增高为特征的代谢性疾病。近几十年来,全世界2型糖尿病(T2DM)的患病率逐渐升高。我国糖尿病患病率从2010年的9.3%上升到10.9%,是全球糖尿病人数最多的国家[1]。糖尿病患者的典型症状表现为三多一少、口干等。目前认为,T2DM发病的重要诱因是血脂代谢的紊乱,因此,T2DM治疗过程中及时控制血糖、调节血脂尤为重要。目前主要通过口服降糖西药治疗,虽然能够有效控制血糖升高,但常出现低血糖症和胃肠道不适等不良反应[2],降低患者生活质量。糖尿病属于中医“消渴病”范畴,中医治疗糖尿病主要方法是清热润燥、养阴生津。中医根据上述治则辨证组方治疗之后,可以发挥出中药的整体调节优势,起到标本兼治的作用,且中药较西药药性温和持久、副作用小[3-5]。
 
中药葛根性凉,具有生津止渴、升阳止泻、解肌退热、通经活络等作用。丹参,苦,性凉,具有活血祛瘀、凉血消痈、通经止痛之功。丹参葛根配伍具有升阳化瘀、通脉止痛的作用,二者作为药对配伍使用治疗2型糖尿病,出自《施今墨对药》,现代医家祝谌予认为葛根丹参药对可治疗消渴兼血瘀以及长期应用胰岛素伴有血管病变的并发症,对改善血液循环,降低血糖、血脂均有较好的疗效[6];陈澈[7]从369篇中医治疗T2DM的相关文献中分析了444个方剂,发现丹参、葛根分别位于治疗T2DM常用中药的第4位和第5位,而丹参葛根药对是中医治疗瘀血阻络、阴虚热盛类T2DM常用药对,二者协同更有利血液运行,常针对瘀血阻滞的病机环境[8]。但丹参葛根药对治疗糖尿病的作用机制尚不明确,有待进一步探讨。本实验通过建立链脲佐菌素(STZ)和高脂饲料结合诱发的2型糖尿病大鼠模型,以评价丹参葛根药对对2型糖尿病大鼠血糖和血脂的药效作用,为丹参葛根的深入研究奠定基础。
 
1 材料
1.1 实验动物
SPF级35~38 d龄雄性大鼠40只,生产许可证号SCXK(粤)2018-0002,体质量110~130 g,广东省医学实验动物中心提供。
 
1.2 实验试剂
STZ(美国Sigma公司,批号B05911);二甲双胍片(北京京丰制药集团有限公司,批号:180951);柠檬酸、枸橼酸钠(分析纯);高脂饲料(广东省医学实验动物中心,批号:20190618);丹参(批号:20160086,产地:山东)、葛根(批号:181101,产地:江西)均购于广州市诚济药业有限公司,分别由广东药科大学中药学院马鸿雁副教授鉴定为唇形科鼠尾草属植物丹参的干燥根及豆科植物葛属植物野葛的干燥根;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒(美康生物科技股份有限公司,批号:190919201);低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒(上海康朗生物科技有限公司,批号:H921);三酰甘油(TG)试剂盒(罗氏诊断有限公司,批号:191051);肌酐(Cr)试剂盒(伊川生物科技有限公司,批号:1951);丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒(迈克生物股份有限公司,批号:1019041);天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒(迈克生物股份有限公司,批号:0719031)
 
1.3 实验仪器
GA-3型安淮血糖仪(三诺生物传感股份有限公司);低温高速离心机(上海赫田,中国);BSA3202S型电子天平(Sarterius,德国);-80 ℃超低温冷冻冰箱(Therno公司,中国);CCA-1112A型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司制造);Arcadia型组织包埋机(Leica公司);RM2235型石蜡切片机(Leica公司)。
 
2 方法
2.1 丹参葛根水煎液的制备
分别称取丹参和葛根,按质量比1∶1比例混合,以2倍水煎煮2次,每次煎煮1 h,2次煎煮后的药液混合过滤,旋转蒸发仪浓缩至每毫升含生药1 g和2 g,分别作为丹参葛根药对的低、高剂量组,药液放置于4 ℃冰箱储存备用。
 
2.2 2型糖尿病大鼠模型的建立
高糖高脂饲料加STZ诱导实验性2型糖尿病大鼠模型[9-10],具体方法:雄性SD大鼠,适应性7 d,体质量(200±20) g。将大鼠随机分为正常组(Z)7只,糖尿病组(M)33只,正常组(Z)组喂以普通饲料,模型组(M)组喂以高脂饲料,持续喂养4周,于喂养的第28天晚禁食过夜,在第29天上午给予模型组大鼠一次性 ip STZ 35 mg/kg,正常组仅注射等体积的柠檬酸-枸橼酸钠缓冲溶液。3 d后全部大鼠禁食不禁水过夜,测量其空腹血糖,2 d后复测空腹血糖值,选择平均空腹血糖值低的再次 ip STZ 15 mg/kg以提高成模率,成模率:96.97 %。
 
2.3 分组及给药
造模成功后,将大鼠随机分为模型组(M)8只,丹参葛根组高剂量组(H)7只,丹参葛根组低剂量组(L)9只,二甲双胍组(Y)8只。丹参葛根高剂量组和丹参葛根低剂量组分别 ig 给予高、低剂量丹参葛根药对3 mL 。模型组(M)和正常组(Z) ig 等量的蒸馏水,二甲双胍组 ig 二甲双胍200 mg/kg,持续给药8周。
 
2.4 样品采集
大鼠经末次给药后禁食12 h,10%(φ)水合氯醛麻醉后将大鼠仰卧固定于固鼠板上,腹主动脉取血,置于采血管,4 ℃,14 500 r/min离心10 min后,取上清液于EP管中,并在-80 ℃冷冻保存备用。同时快速取出大鼠肾脏及胰腺置于PBS溶液中,冲洗干净后用4%(φ) 多聚甲醛溶液固定24 h,流水冲洗6 h 后石蜡包埋,切片。
 
2.5 药效学研究
观察造模前后及给药后各组大鼠神态、毛色、摄食、饮水、体质量及活动等变化,称量并记录每周大鼠的体质量、摄食量和平均饮水量,造模后每隔1周所有大鼠禁食不禁水12 h测空腹血糖值。
 
HE染色后观察胰腺及肝脏组织学变化。按照相关试剂盒步骤分别测定血清TC、TG、LDL-C、ALP、Cr、ALT、AST 7项指标。
 
2.6 统计学方法
所有实验数据输入SPSS 22.0统计学软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)处理数据,实验结果以x¯±s表示,采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
 
3 结果
3.1 丹参葛根药对对2型糖尿病大鼠体质量的影响
造模成功后正常组大鼠体质量明显高于模型组,且正常组大鼠毛色白,亮,有光泽,活泼,模型组和给药组大鼠毛色发黄,无光泽感,精神状态不佳。
 
在实验期间,给药初期模型组大鼠体质量与正常组相比,体质量明显下降(P<0.01),多饮多尿症状显著。随着实验的进行,给药组较模型组相比,体质量有明显升高,其中,丹参葛根高剂量组体质量与模型组体质量差异更明显。给药末,给药组大鼠多尿、多饮、多食症状有所减轻,丹参葛根低剂量组、丹参葛根高剂量组及二甲双胍组体质量较模型组差异有统计学意义(P<0.05,P<0.05,P<0.01)。结果见图1。
3.2 丹参葛根药对对2型糖尿病大鼠空腹血糖的影响
实验结果表明,造模后,除正常组以外,其余各组血糖均明显升高,模型组与正常组相比差异有统计学意义(P<0.01)。二甲双胍组和丹参葛根高、低剂量组均与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。实验结果表明:丹参葛根药对能有效降低2型糖尿病大鼠空腹血糖值。见表1。
 
表1 丹参葛根药对对2型糖尿病大鼠血糖的影响
3.3 丹参葛根药对对2型糖尿病大鼠血脂指标的影响
如表2,与正常组相比,模型组大鼠血清中TG、TC及LDL的含量极显著升高(P<0.01),说明糖尿病大鼠体内发生了明显的脂代谢紊乱,而丹参葛根高、低剂量组血脂水平明显下降,接近正常组,说明丹参葛根具有改善糖尿病脂代谢紊乱的作用。
 
3.4 丹参葛根药对对2型糖尿病大鼠肝、肾功能指标的影响
如表3所示,模型组大鼠血液中AST、ALT及ALP、Cr的含量显著高于正常组(P<0.05或P<0.01)。丹参葛根药对组AST、ALT及ALP、Cr含量极显著下降(P<0.01),说明丹参葛根对肝肾功能有一定的保护及修复作用。
 
表2 丹参葛根药对对2型糖尿病大鼠血脂指标的影响
表3 丹参葛根药对对2型糖尿病大鼠肝肾功能指标的影响
3.5 生化指标热图分析
数据聚类然后展示聚类热图是近年来数据分析常用的方法之一,以渐进的蓝色和红色展现出数据的疏密以及频率的高低。本文用组间的血脂指标构建热图,直观地展现出各指标在样本间的变化趋势,更清晰地表示组间血脂指标的差异性。见图2。
 
 
热图是以颜色梯度来代表数据矩阵中数值的大小并根据样品丰度相似性进行聚类的一种图形展示方式。将高丰度和低丰度的组别分块聚集,通过颜色梯度及相似程度来反映多个样品群落组成的相似性和差异性。热图聚类结果中,颜色代表代谢物丰度;纵向聚类表示不同生化指标在各样品间丰度的相似情况,两组间距离越近,枝长越短,说明这两组在各样品间的丰度越相似;横向聚类表示不同样品的各生化指标丰度的相似情况,与纵向聚类一样,两样品间距离越近,枝长越短,说明这两个样品的各生化指标丰度越相似。热图对应的值为每一行样品的相对丰度经过标准化处理后得到的值,颜色梯度由蓝色到红色表示相对丰度由低到高。图2中正常组与丹参葛根低剂量组两组间距离较近,枝长较短,且指标含量颜色接近,说明两组之间生化指标丰度相似,进一步说明了经过丹参葛根治疗后的大鼠与正常组大鼠各生化指标接近。图像中每一行代表一个样本,每一列代表一个血脂指标,图像右边对样本进行聚类分析,下面对血脂指标进行聚类分析,颜色越红表示指标含量越高。图中可以看出与对照组相比,模型组血脂与肝肾功能指标颜色显著不同,丹参葛根高、低剂量组指标相对于模型组均下调,说明丹参葛根能有效调节脂代谢紊乱及肝脏和肾脏的损伤。
 
3.6 各组大鼠肾脏以及胰腺石蜡切片HE染色结果
结果见图3。正常组大鼠肾脏未见异常,肾小管排列整齐。模型组大鼠肾小球萎缩,数量减少,系膜区细胞外基质增生,并伴有局灶性的炎性细胞浸润,丹参葛根药对组肾脏病变明显轻于模型组,肾小球基底膜厚度减小,增生明显改善。正常组大鼠胰腺组织排列紧密,胰岛为规则的椭圆状细胞团,胰岛β细胞大小基本一致,界限明显。模型组大鼠可见胰腺组织排列疏松,细胞形态不一,胰岛体积缩小且有空虚区域,腺泡间间质增多。丹参葛根药对组大鼠胰岛细胞排列疏松得到改善,结构损伤较轻,胞质略不均匀,胰岛细胞分布较规则。表明丹参葛根药对对2型糖尿病大鼠伴发的肾脏和胰腺损伤具有改善作用。

 
 
4 讨论
糖尿病是一种以高血糖为主要临床特征的代谢性疾病,已成为继心血管疾病及肿瘤之后又一严重威胁人体生命健康的非传染性疾病[11-12]。常伴有肾脏损伤、视网膜病变、动脉粥样硬化等多种严重并发症。临床研究表明[13-14],机体长时间处于高糖状态时,会引发血脂代谢异常,产生过多活性氧自由基、糖基化终产物,使血管或脏器长期处于炎症状态,引起血管壁增厚,管腔狭窄等为主要表现的血管重构及器质性或功能性的脏器损害。
 
研究表明,糖尿病患者血脂异常时TC、TG的含量显著升高[15]。糖尿病患者普遍胰岛素水平降低或胰岛素抵抗,使依赖于胰岛素功能的脂蛋白脂肪酶的活性降低,水解TG的能力下降,导致患者体内TG含量显著增高[16]。另外2型糖尿病发生时,机体对葡萄糖的利用失调,脂肪分解增加,大量多余的脂肪酸被释放入血,引起β细胞脂性凋亡、胰岛素分泌减少,同时血中TC、TG含量增多,血管弹性降低,动脉内膜增厚,进一步加重2型糖尿病。LDL-C是动脉粥样硬化性心血管疾病发生和发展中最主要的危险因素。研究表明B型LDL(sd-LDL)对LDL受体的亲和力较低,血浆清除延迟,同时与蛋白聚糖结合力较强,增加了其在动脉壁中的滞留时间而更易被氧化,导致动脉粥样硬化发生[17]。本研究中经丹参葛根治疗的糖尿病大鼠TC、TG及LDL水平低于模型组,有效调节2型糖尿病引起的血糖及血脂的紊乱。
 
肝脏作为胰岛素作用的靶器官,肝脏受损直接影响葡萄糖的摄取和利用,使机体代谢紊乱加重,易导致2型糖尿病患者体内发生胰岛素抵抗[18]。ALT、AST、ALP是反映肝功能损伤的重要指标,有研究表明,当肝脏发生严重损坏或坏死时,AST水平同样也会显著升高,且升高程度与肝细胞受损程度一致[19]。本实验用药组AST和ALT较模型组含量显著下降(P<0.05),说明丹参葛根对肝脏有一定的保护作用。血清Cr是临床常用评估肾功能的指标,血清内Cr含量过高意味着肾小球滤过功能受损。血Cr水平升高与糖尿病、脂质代谢紊乱、心血管疾病等的发生有关[20],Cr降低有助于调节脂质代谢。本研究结果证实丹参葛根能有效降低Cr水平,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。
 
综上所述,2型糖尿病体内血糖血脂紊乱并出现一定程度的肝肾损伤,丹参葛根的干预有助于减轻2型糖尿病大鼠糖脂代谢紊乱从而减少肾脏及肝脏损伤的发生。但是糖尿病及其并发症的机制十分复杂,因此丹参葛根药对对治疗2型糖尿病的具体作用机制仍需后期进一步研究。
 
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