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维生素E抗氧化应激损伤的作用效果与机制

更新时间:2020-06-08 09:33点击:

摘要: 目的探讨维生素 E 在体内外的应激损伤。方法 体外实验: 人肝 RBL 细胞系根据 H2O2损伤及损伤前后给予维生素 E 分为 4 组,对照组( C) 、H2O2损伤组( Ec) 、H2O2损伤前( Eb) 及后( Ea) 给维生素 E 组; 体内实验: 将 20只清洁级雄性 Wistar 大鼠分为对照组和大及小剂量维生素 E 组,每天进行一次 35 和 15 mg/kg 溶液 2 mL 灌胃,连续 3 d.体外实验应用 MTT 和 TUNEL 法检测细胞存活率和凋亡率,免疫印迹和免疫组化方法检测细胞中 NF-κB、Hsp-70、Bcl-2、Bax 及 caspase-3 的表达水平; 体内实验应用生化法检测 3 和 6 d 后血浆内 T-AOC、SOD、GSH 和 MDA的水平。结果 H2O2损伤组( Ec) 细胞凋亡率增加( P < 0. 01) ,细胞内 Bax、Hsp-70、NF-κB 及 caspase-3 显着升高( P <0. 01) ,而 Bcl-2 显着下降( P <0. 01) ,维生素 E 干预后能显着缓解上述变化( P < 0. 01) ,H2O2损伤前干预效果优于后干预。灌胃后 3 d 血浆中 T-AOC、SOD、GSH 的水平增高,MDA 降低( P <0. 01) ,6 d 后其相关指标变化更加显着( P <0. 05) .结论 维生素 E 可通过调节人肝 RBL 细胞相关蛋白表达水平和 Wistar 大鼠血浆中抗氧化酶体系而发挥抗氧化作用。
  
  关键词:维生素 E; H2O2; 抗氧化酶体系; 抗凋亡信号传导。
  
  Abstract: Objective To explore the antioxidant effect of vitamin E on both in the rat in vivo and in hepatic RBLcells in vitro. Methods The cultured human hepatic RBL cells were exposed to H2O2as an oxidant and treated with0. 4mM doze of Vitamin E before or after exposure of H2O2. The cell survival and apoptosis were detected by MTTand TU-NEL assays. The expression level of NF-kB,Bcl-2,Bax,Hsp-70 and caspase-3 was determined by immuno-histochmistry and Western blot. 20 clean level male Wistar rats were divided into control group and the big andsmall doses of vitamins E35 and 15 mg / kg 2 mL lavage solution,1 time a day,a total of three times,the biochemicalmethod was performed to detect within the plasma after 3 and 6 d T-AOC,SOD,GSH and MDA levels.Results H2O2damage group ( Ec) apoptosis rate increased ( P < 0. 01) ,intracellular Bax,HSP-70,the NF-kappaB and caspase 3 significantly higher ( P < 0. 01) ,while the Bcl-2 decreased significantly ( P < 0. 01) ,vitamin E af-ter the intervention can significantly alleviate the above changes ( P < 0. 01) ,H2O2damage before intervention wasmilder than that after intervention. Lavage after 3 d plasma T-the AOC,SOD,higher level of GSH,MDA lowered( P <0. 01) ,and 6 d after the relevant index change was more significant( P <0. 05) . Conclusions The resultsshowed that the vitamin E displays anti-oxidant capacity through upregulating the antioxidant enzyme system andregulating the expression of relevant proteins.
  
  Key words: vitamin E; hydrogen peroxide; anti-oxidant enzyme system; anti-apoptoic signal transduction.
  
  氧化应激包含反应氧族 ROS 和反应氮族 RNS,两者皆可呈现双重作用,过度氧化应激致使线粒体电子传递链 ROS/RNS 的过量积累损伤细胞的类脂和 DNA 等[1].本课题组曾研究并证明金银花对大鼠体内外具有抗氧化作用[2].维生素 E 在体内可保护细胞不受氧化剂的损害[3],在体外实验中,能够抑制炎症反应、细胞黏附和平滑肌细胞增殖等[4].
  
  维生素 E 是通过细胞信号传导和基因调节发挥其生物学作用[5-7].而近期研究又发现维生素 E结合蛋白具有受体功能的作用。尽管有如此多的发现,但对于维生素 E 的作用机制探讨较少[8].对维生素 E 的分子事件进行深入研究,有助于临床干预。本研究目的将从体内外两个方面探讨维生素 E抗氧化应激损伤的作用效果和作用机制。
  
  1 材料与方法。
  
  1. 1 材料。
  
  1. 1. 1 细胞: 人肝 RBL 细胞系( 广州医科大学细胞库) .大鼠: 清洁级雄性 Wistar 大鼠,体质量 210 ~250 g[北京维通利华实验动物技术有限公司,合格证号 SCXK( 京) 2010-2011].
  
  1. 1. 2 试剂: 维生素 E 注射液( 上海第九制药厂) ;胎牛血清; DMEM ( Sigma 公司) ; TUNEL 试剂盒( Promega 公司) ; 单克隆抗体 ( Invitrogen 公司) ;T-AOC、SOD、GSH、MDA 试剂盒( 南京建成生物工程研究所) .
  
  1. 2 方法。
  
  1. 2. 1 实验细胞分组及处理: 人肝 RBL 细胞根据H2O2损伤及损伤前后给予维生素 E 分为4 组,对照组( C) 、H2O2损伤组( Ec) 、H2O2损伤前( Eb) 及后( Ea) 给维生素 E 组,如表 1.
  
  1. 2. 2 MTT 检测: 制备 5 × 104/ mL 细胞悬液,接种于 96 孔板,每孔细胞悬液加 200 μL.24 h 后分组,( 每组做 5 个平行孔) 加入不同浓度的维生素 E 和H2O2溶液培养 24 h.每孔加 20 μL MTT,培养 4 h.弃去上清液,加 DMSO 200 μL/孔,震荡器上充分震荡溶解。在酶标仪上490 nm 波长处读取 A 值,取平均值。细胞存活率 = 处理组 A/对照组 A ×100%,抑制率 = ( 1 - 处理组 A/对照组 A) ×100%.
1. 2. 3 TUNEL 实验: 取 4% 多聚甲醛固定后的 4 组细胞滴片,冷风吹 4 h,0. 3% Triton X-100/PBS 透化后,37 ℃蛋白酶 K 消化 8 min,TdT( 末端脱氧核苷酸转移酶) 缓冲液,1 μL TdT 酶及 1 μL Bio-dUTP/玻片,置于湿盒 37 ℃ 1. 5 h.BCIP/NBT 底物显色,甲基绿复染。阴性对照实验不加 TdT 酶。每组细胞滴片选取 10 个视野,计数 500 个细胞,计算阳性细胞所占百分比即各组细胞凋亡率。
  
  1. 2. 4 免疫组化: 4% 多聚甲醛固定后的细胞标本,加入 0. 3% Triton X-100/PBS 透化后,加 10% 正常的羊血清封闭,除多余血清,加 1∶ 100 稀释的各种一抗置 4 ℃湿盒内孵育过夜。PBS 洗后,加 1∶ 200 稀释的二抗( 鼠 IgG-HRP) ,置37 ℃湿盒内孵育1. 3 h,以 DAB 显色。阴性对照实验用 PBS 代替一抗,应用图象分析仪扫描各标本免疫印迹信号的吸光度值A,即各相关蛋白表达量。
  
  1. 2. 5 Western blot: 应用有机溶剂萃取方法提取蛋白。制备 SDS-PAGE,电泳条件 85 V、1. 5 h.电转仪 4 ℃下转到硝酸纤维素膜上,将硝酸纤维素膜与1∶ 100 稀释的各种一抗反应 2 h,再与 1∶ 200 稀释的二抗室温下反应 1 h.加入底物显色,以 β-actin 为内参照,阳性条带出现棕色后终止反应,应用薄层层析扫描仪进行扫描。
  
  1. 2. 6 动物实验: SPF 级雄性 Wistar 大鼠,体质量210 ~ 250 g,分为对照组及大和小剂量实验组,分别给予蒸馏水及35 和15 mg/kg 维生素 E 溶液2 mL灌胃 3 次,间隔 12 h.在灌胃前和后 3 及 6 d 取血,分离血浆,检测大鼠血浆中 T-AOC、SOD、MDA 和 GSH的含量,严格按各试剂盒说明进行。
  
  1. 3 统计学分析用 SPSS 16. 0 软件进行统计学分析,各组数据均用均值和标准差( x ± s) 表示,进行单因素方差分析,对细胞的存活率和凋亡率应用 χ2检验。
  
  2 结果。
  
  2. 1 细胞实验结果。
  
  2. 1. 1 细胞存活率和凋亡率: H2O2损伤组较对照组存活率下降而凋亡率升高( P < 0. 01) ,维生素 E干预组显着减轻上述变化( P <0. 01) ( 图 1) .
2. 1. 2 维生素 E 保护对人 RBL 肝细胞相关蛋白表达水平的影响: H2O2损伤组 ( Ec) Bax、Hsp-70、NF-κB及 caspase-3 显着升高( P < 0. 01) ,而 Bcl-2 显着下降( P <0. 01) ,维生素 E 干预后能显着缓解上述变化( P <0. 01) ,H2O2损伤前干预效果优于后干预( 表 2) .
  
  2. 1. 3 Western blot 检测维生素 E 对人 RBL 肝细胞相关蛋白表达水平的影响: H2O2组较对照组,Hsp-70、NF-κB 和 Bax 的表达水平明显增高 ( P <0. 01) .Eb 组 / Ea 组上述指标明显降低( P < 0. 01)( 图 2) .
2. 2 Wistar 大鼠维生素灌胃前及后血浆中抗氧化酶体系水平的变化灌胃后 3 d 血浆中 T-AOC、SOD、GSH 的水平增高,MDA 降低( P <0. 01) ,6 d 后其相关指标变化更加显着( P <0. 05) ,结果见表 3.
 3 讨论。
  
  H2O2为氧化损伤剂[10]可诱导细胞产生大量的ROS,而 ROS 不仅能生成第二信使,其本身也可作为第二信使发挥作用[11].细胞内的氧化还原状态,能直接或间接的影响 NF-κB 的转录和基因的表达[12].维生素 E 可以通过 ROS-NF-κB 途径抑制血管平滑肌细胞氧化应激反应,降低 ROS 和 NF-κB 的表达水平[13].本研究结果显示,与 H2O2损伤组相比,维生素 E 可明显减低 NF-κB 的表达水平。
  
  维生素 E 可下调 Hsp-70 的表达水平,起到氧化应激的保护作用[14].维生素 E 还可通过下调 Bcl-2和 caspase-3,上调 Bax 的表达水平,抑制小鼠细胞的凋亡。NF-κB 通过激活热休克因子-1 诱导 HSPs的表达,而高表达的 Hsp-70 又与 NF-κB/I-κB 结合形成复合物,抑制 NF-κB 的核转位,降低 NF-κB 的活性。本课题研究结果表明,维生素 E 具有明显的的抗凋亡能力,且前保护组的抗凋亡能力优于后保护组。维生素 E 在抗氧化应激中,下调 NF-κB、Hsp-70、Bcl-2 和 caspase-3 的表达,上调 Bax 的表达,提示维生素 E 可能通过阻抑 NF-κB 信号传导途径,抑制 Hsp-70 的合成,提高 Bcl-2/Bax 比 率,阻 抑caspase 级联反应,抑制细胞凋亡,而呈现抗氧化的保护作用。
  
  机体抗氧化防御体系主要包括 SOD 和 GSH等,而 MDA 水平的高低可反映体内氧自由基的平衡状态。本研究动物实验结果显示,与灌前实验组相比,维生素 E 灌胃后 3、6 d 血浆中 SOD 和总抗氧化能力均显着增加,MDA 含量却明显降低,并存在用量和时间的依赖性,提示维生素 E 是通过上调体内抗氧化酶体系来提高抗氧化能力。
  
  ROS 含量的增加可导致细胞的损伤,其作用可被体内的抗氧化防御酶体系所抑制[15].化学损伤剂诱导肝细胞凋亡的机制与细胞因子含量的增加或氧化应激反应程度的增加有相关性[22].大量的ROS 可导致 LPO 的生成,而 LPO 是造成肝细胞损伤和肝纤维化的主要因素。维生素 E 可抑制 ROS 的产生,对氧化应激造成的肝细胞损伤具有一定的保护作用。本研究通过观察不同检测指标在体内外实验中的变化,从而探讨维生素 E 抗氧化作用机制和维生素 E 的抗氧化效果。
  
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