27医学论文范文网

主页
分享医学论文范文

评价生物素营养的主要技术综述

更新时间:2020-07-29 08:22点击:

    摘要:生物素是一种水溶性维生素,是哺乳动物体内羧化酶的辅酶,参与糖脂和能量代谢。同时,生物素还参与基因表达、代谢和机体的生长发育过程。近年来有关生物素缺乏弓|起的机体健康营养状况改变的研究较多,尤其是孕期生物素缺乏对胎体致畸作用的发现,引起人们对生物素缺乏的广泛关注。然而,关于生物素营养状况评价方法存在较多的争议,没有统一的结论,本文对生物素营养状况评价方法进行综述。
 
    关键词:生物素生物素缺乏评价指标
 
生物素(biotin) 又称维生素H、维生素B7,是一种水溶性维生素,广泛分布于动植物组织。生物素作为哺乳动物体内5种羧化酶的辅酶,参与糖原异生、脂肪酸合成、氨基酸分解和能量的代谢[1-2].生物素可以通过参与组蛋白的生物素化,来参与染色质相关蛋白质及组蛋白修饰的下游事件[3-4],影响胰岛素分泌,导致糖尿病、免疫性疾病[5]的发生。
  
  哺乳动物肠道细菌可以产生生物素[6],人体一般不需从食物中额外补充,故生物素渐渐成为“被遗忘”的维生素。服用抗惊厥药物[7]、不当饮食习惯( 长期食用生鸡蛋清、吸烟、饮酒等) 致肠道菌群正常活动受损,或者先天性生物素相关酶的缺乏( 如羧化酶全酶合成酶,HCS) 可致生物素缺乏,主要表现为皮肤和神经系统症状,患者表现为不同程度的体重减轻、脱发、脂溢性皮炎、结膜炎等。多种动物实验结果表明生物素缺乏还有致畸[8-9]、致死作用。
  
  直到21世纪初美国MOCK等[10-12]通过测定孕期妇女血清生物素和尿中3-羟基异戊酸(3-hydroxyisovaleric acid,3HIA) 含量,指出尽管膳食摄入正常含量生物素,仍有近1 /2的孕妇出现生物素缺乏的现象。生物素再次引起人们的关注,并使得有关生物素生理状况的评价技术成为研究的热点。部分学者使用血尿中酰基肉碱含量[13]的变化来判断生物素营养状况。然而关于生物素营养状况指标测定方法较多,各方法之间的关联性、评价技术的敏感性和特异性以及各种指标正常范围值尚未有统一结论,因此本文对生物素营养状况评价技术的相关研究进展做一综述。
  
  1生物素在体内的代谢途径
  
  生物素通过与体内羧化酶上赖氨酸残基的ε-氨基基团共价结合形成羧化酶的辅酶,即丙酰辅酶A羧化酶(PCC)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(MCC) 和丙酮酸羧化酶(PC) ,参与体内氨基酸代谢、脂肪酸合成和糖代谢[1-2]过程。哺乳动物体内生物素通过参与羧化酶的正常代谢,转化为双降生物素、生物素硫氧化物以及生物素砜等[3].当羧化酶的活性下降时,生物素的代谢通路发生变化。ACC活性下降,丙二酰辅酶A活性改变,生成较多乙酰肉碱和丙酰肉碱。实验证明3HIA和3HIA-肉碱是亮氨酸代谢的产物,当3-甲基巴豆酰辅酶A活性下降时,MCC代谢途径变化,生成较多的3HIA和3HIA-肉碱。而3-甲基巴豆酰辅酶A的活性与生物素的水平密切相关,因此MOCK建议使用尿液中有机酸的含量来表示生物素的营养状况。
  
  2生物标志物的选择
  
  血清和尿液中生物素的浓度及其代谢产物可作为生物素营养状况的潜在标志物。研究表明,外周血淋巴细胞生物素依赖羧化酶活性可以较早反应人体生物素边缘性缺乏。同时最新研究表明羧化酶MCC活性下降可导致机体血浆和尿液中3HIA、3HIA-肉碱等有机酸含量增加,可作为评价早期生物素营养缺乏的敏感指标。
  
  3生物素营养状况评价方法
  
  3. 1微生物法
  
  微生物法一直是生物素分析的传统方法,其原理是在一定生长条件下,利用特殊细菌生长与生物素含量之间的线性关系测定血浆和尿液中总的生物素含量。微生物法灵敏性强,可以测定具有生物活性的生物素,但是无法区分生物素的衍生物及代谢形式,无法了解生物素代谢过程中的变化,容易低估生物素的生物利用率,且测定过程比较繁琐,测试周期长,结果重复性差,因此同次实验内结果比较尚可,但是不同实验间的横向比较结果差异较大,推广应用受限。
  
  3. 2酶联免疫吸附试验
  
  酶联免疫吸附试验(ELISA) ,利用生物素与链霉亲和素的强亲和力,通过特异性识别来检测生物 素 的 含 量,是 一 种 通 用 的 测 定 方 法。MISHRA等[14]采用生物素与链霉素亲和素标记的过氧化物酶的竞争反应,测定链霉素亲和素过氧化物酶的含量来间接测定生物素的含量。结果显示健康成年男性和女性尿中生物素含量分别为(9. 0 ± 5. 4) 及(7. 0 ± 2. 1)μmol/mol肌酐,该方法在100 ~ 1000 pmol/L的回收率分别为108%及112. 5%,对实验结果存在高估现象。ELISA法专一性强,快速且灵敏,可以自动化; 但是试剂盒价格昂贵,结果受操作因素影响较大,结果不稳定。
  
  3. 3 H14CO3-incorporation assay
  
  H14CO3-incorporation assay利用PCC将14C-碳酸盐整合到甲基丙二酰辅酶A上,通过测定甲基丙二酰辅酶A活性来间接判断生物素的水平。STRATTON等[12]测定8个健康成年人在服用足量生鸡蛋蛋白后PCC活性的变化: 在第14天时所有受试者PCC活性均将至第0天正常水平的下限。验证了生物素水平与PCC活性之间的线性关系。PCC活性不依赖于肾功能,对于肾功能下降或特殊生理状况人群( 如孕妇) 的测定结果不受影响。但其测定技术要求比较高。在样品处理过程要保持PCC活性; (1) 分离过程中,要避免溶血; (2) 样品处理时间要短,避免PCC活性绝对值下降; (3) 避免血液中PCC活性随着样品处理过程发生变化; (4) 不适于人体长期的生物素营养状况的检测工作。
  
  3. 4蛋白质印迹法
  
  蛋白质印迹法将电泳分离后的羧化酶从凝胶转移到固相支持物PVDF膜上,然后用特异性抗体检测特定抗原的技术。日本学者ENG等[15]使用Western Blots法测定血清羧化酶活性,结果发现: (1) 仪器检测到的holo-PC的信号太弱;ACC未检测到; (2) 生物素缺乏组MCC、PCC的丰度为4. 1、4. 1; 生物素足量组为8. 2、9. 1,添加生物素组为15. 7、17. 0.链霉素亲和素-HRP检测,避免放射性标记过程,特异度较高,可利用条带光密度定量分析。但是该方法在制胶、跑胶方面要求比较高,且无法检测ACC活性,有待改进。
  
  3. 5色谱测定技术
  
  3. 5. 1 HPLC-Avidin binding assay高效液相色谱法在生物素测定方面受到一定的限制。传统的色谱柱无法将生物素与其他干扰物质有效分离开来。1990年美国学者MOCK利用生鸡蛋蛋白( 含抗生物素蛋白) 与生物素特异性结合作用,采用色谱技术将生物素与其它物质分开的原理,建立了HPLC-Avidin binding assay测定生物素含量。该方法不仅可以测定血浆和尿中总的生物素含量,还可以测定各种结合形式的生物素。MOCK等[16]测定健康成年人血清生物素含量,结果表明血清中共价结合生物素占12%,可逆性结合生物素占7%; 游离 态 生 物 素 占81% .随 后MOCK等[17-18]使用该方法分离出血浆、尿中生物素的代谢产物,15个健康成年人血浆生物素含量为(244 ±61)pmol / L,代谢产物双降生物素含量为 (189 ±135)pmol / L、生物素硫氧化物含量为 (15 ± 33)pmol / L.测定10个健康成年人尿中生物素的含量为(41 ± 18)nmol/24 h肌酐,代谢产物双降生物素含量为(26 ± 10)nmol/24 h肌酐、生物素硫氧化物含量为(10 ± 5)nmol/24 h肌酐,尿中生物素占总生物素约43%,双降生物素占29%,硫氧化物占约11%,未知成分占17% .抗生物素蛋白不仅可与生物素及其衍生物结合,还可与脂酸结合,同时与酸性乙醇磷酸缓冲液中其它干扰物质的峰区分不明显,测定方法有待进一步改进。 针对以上方法存在的各种缺陷,2009年日本学者HAYAKAWA等[19]对色谱柱的处理进行改进,利用胰蛋白酶处理的抗生物素蛋白固定色谱柱(Bioptic AV-1,33 mm × 4. 6 mm i. d.) 特异性分离纯化生物素,然后用衍生剂ADAM将其衍生化为荧光 性 的biotin-ADAM酯,再 通 过 激发 波 长365 nm、发射波长412 nm下测定biotin-ADAM酯的荧光度确定生物素含量。结果显示血浆生物素回收实验回收率高达98%,血浆中游离生物素回收率为(70. 7 ± 10. 9)%(CV为15. 4%)。该方法分析速度快、可靠、敏感、准确性高,同时不受其他营养素、抗生物素物质的干扰。
  
  3. 5. 2 GC / MS法1989年MOCK等[20]使用GC / MS法测定成年人尿液中3HIA,同时实验处理过程中引入了3HIA内标,测得尿中3HIA的含量为(112 ± 38)μmol/24 h肌酐。实验发现尿液中有机酸浓度和酰基肉碱底物水平的变化与体内生物素水平有明显的相关性,提示可作为评价生物素 营 养 状 况 的 有 效 指 标。 GC /MS法 测 定3HIA,样品制备过程复杂、耗时长; 技术要求高;同时3HIA的标记物在微量的水中就会水解,要求对样品及时分 析,使 得GC /MS的 推 广 使用受限。
  
  3. 5. 3 UPLC-MS / MS法THOMAS等[21]针对上述缺点进行改进,采用UPLC-MS /MS测定8个健康成 年 人 正 常 尿 样3HIA含 量,其 平 均 值 为(8. 5 ± 3. 2)mmol/mol肌酐。与GC /MS的结果相比后,两 种 方 法 测 定 数 据 之 间 的 相 关 性 为0. 97. BOGUSIEWICZ等[22]使 用 该 方 法 测 定10个生物素缺陷成年人尿液中酰肉碱底物浓度的结果显示: 随着生鸡蛋蛋白摄入时间的延长,尿液中Pc∶ MMc、3HIAc∶ MGc、Ac∶ Mc比值明显上升,分别代表了羧化酶PCC、MCC和ACC活性的下降。研究结果显示这3对比值可以较好地反映人体边缘性生物素缺乏状态。这3对比值中的一项或3项联合使用对于发现孕妇早期生物素缺乏具有重要的意义。UPLC-MS /MS可以精确地分析生物素相关代谢产物的含量,不需要对样品进行提取和衍生化处理[22].尿液中3对肉碱底物比值的测定,不受样品处理时间的影响,同时不需要个体酰基肉毒碱内标或制作标准曲线[21,23-25],检测能力高、花费少,适合大人群快速测定工作。
  
  3. 5. 4 LC-MS / MS法 近年来HORVATH等[23]建立了LC-MS /MS法测定生物素缺陷成年人血浆中3HIA-肉碱的含量,而3HIA-肉碱的生成与生物素代谢途径中MCC活性下降有关[26],而MCC的活性( 排除MCC基因的缺陷) 与体内生物素的水平密切相关。HORVATH等[23]使用该方法测定生物素缺陷者尿液中3HIA-肉碱的浓度,标准曲线回归系数为0. 9992,准确度为3. 79% ~ 5. 8%RE.HORVATH等[24]同时对有无液固萃取或液液萃取过程(SPE) 结果做了比较,结果发现二者之间存在强相关性(r = 0. 996) ,可以将SPE过程省略,提高分析速率。
  
  血浆中3HIA-肉碱较少受到肾功能的影响,使用LC-MS /MS测定3HIA-肉碱,通过测定准确度、精确度、检测限和动态范围来校正多种潜在性可能影响或引起机体生物素缺乏的因素[23].同时LC-MS /MS测定3HIA-肉碱内标误差要比PCC的误差小,在各种液体基质中相对比较稳定,储存条件分布范围: 室温~ - 80 ℃[27].LC-MS /MS法测定 尿 液 中3HIA-肉 碱 的 浓 度 要 比 测 定 血 清3HIA-肉碱更方便,因为尿样的处理相对简单、花费低,没有SPE过程; 兼具血清3HIA-肉碱测定的优点,便于在临床上推广使用[25].
  
  4展望
  
  目前关于生物素营养状况评价方法的研究较多,研究趋势主要集中在以下几个方面: (1) 确定有效的生物标志物,能够反应生物素的代谢及生物作用水平; (2) 相关指标在人体内的正常范围值; (3) 各指标不同生物作用水平之间的关联性;(4) 基质较复杂样品如血浆、尿液中生物素及相关代谢产物含量的测定技术尚不成熟,需要建立敏感、高效和快捷的色谱技术。因此,关于生物素营养状况评价方法还有待深入研究,为生物素代谢评价及生物学应用方面提供依据。
  
  参考文献
  
  [1]KUROISHI T,ENDO Y,MURAMOTO K,et al.Biotin deficiency up-regulates TNF-alpha productionin murine macrophages[J]. J Leukoc Biol,2008,83(4) :912-920.
  [2]PINDOLIA K,JORDAN M,GUO C,et al.Development and characterization of a mouse withprofound biotinidase deficiency:a biotin-responsiveneurocutaneous disorder[J]. Mol Genet Metab,2011,102(2) :161-169.
  [3]ZEMPLENI J,WIJERATNE S S,KUROISHI T.Biotin[M]/ / ERDMAN J W,Jr,MACDONALDI A,ZEISEL S H eds. Present Knowledge in Nutrition,10th edition. ILSI. Wiley-Blackwell,2012.
  [4]HASSAN YI,ZEMPLENI J. A novel,enigmatichistone modification:biotinylation of histones by holo-carboxylase synthetase[J]. Nutr Rev,2008,66:721-725.
  [5]MATHEY K C,GRIFFIN J B,ZEMPLENI J. Biotinsupply affects expression of biotin transporters,biotinylation of carboxylases and metabolism ofinterleukin-2 in Jurkat cells[J]. J Nutr,2002,132(5) :887-892.
  [6]BURKHOLDER P R,MCVEIGH I. Synthesis ofVitamins by Intestinal Bacteria[J]. Proc Natl AcadSci USA,1942,28(7) :285-289.
  [7]MOCK D M,MOCK N I,NELSON R P,et al.Disturbances in biotin metabolism in childrenundergoing long-term anticonvulsant therapy[J]. JPediatr Gastroenterol Nutr,1998,26(3) :245-250.
  [8]ZEMPLENI J,MOCK D M. Marginal biotindeficiency is teratogenic[J]. Proc Soc Exp BiolMed,2000,223(1) :14-21.
  [9]SEALEY W M,STRATTON S L,MOCK D M,etal. Marginal maternal biotin deficiency in CD-1 micereduces fetal mass of biotin-dependent carboxylases[J]. J Nutr,2005,135(5) :973-977.
  [10]MOCK D M,QUIRK J G,MOCK N I. Marginalbiotin deficiency during normal pregnancy[J]. Am JClin Nutr,2002,75(2) :295-299.
  [11]MOCK D M,STADLER D D. Conflicting indicatorsof biotin status from a cross-sectional study of normalpregnancy[J]. J Am Coll Nutr,1997,16(3) :252-257.
  [12]STRATTON S L,BOGUSIEWICZ A,MOCK M M,et al. Lymphocyte propionyl-Co A carboxylase and itsactivation by biotin are sensitive indicators ofmarginal biotin deficiency in humans[J]. Am J ClinNutr,2006,84(2) :384-388.
  [13]BOGUSIEWICZ A,HORVATH T D,STRATTON SL,et al. Measurement of acylcarnitine substrate toproduct ratios specific to biotin-dependentcarboxylases offers a combination of indicators ofbiotin status in humans[J]. J Nutr,2012,142(9) :1621-1625.
  [14]MISHRA S,STORER M B,SHERWIN C M,et al.A simple binding assay for the direct determination ofbiotin in urine.[J]. Clin Chim Acta,2005(12) :60-66.
  [15]ENG W K,GIRAUD D,SCHLEGEL V L,et al.Identification and assessment of markers of biotinstatus in healthy adults[J]. Br J Nutr,2013,110(2) :321-329.
  [16]MOCK D M,MALIK M I. Distribution of biotin inhuman plasma:most of the biotin is not bound toprotein[J]. Am J Clin Nutr,1992,56(2) :427-432.
  [17]MOCK D M,LANKFORD G L,CAZIN J,Jr. Biotinand biotin analogs in human urine:biotin accountsfor only half of the total[J]. J Nutr,1993,123:1844-1851.
  [18]MOCK D M,LANKFORD G L,MOCK N I. Biotinaccounts for only half of the total avidin-bindingsubstances in human serum[J]. J Nutr,1995,125:941-946.
  [19]HAYAKAWA K,KATSUMATA N,ABE K,et al.Wide range of biotin(vitamin H)content infoodstuffs and powdered milks as assessed by high-performance affinity chromatography[J]. Clin PediatrEndocrinol,2009,18(1) :41-49.
  [20]MOCK D M,JACKSON H,LANKFORD G L,MOCK N I. Quantitation of urinary 3-hydroxyisovaleric acid using deuterated 3-hydroxyisovaleric acid as internal standard[J].Biomed Environ Mass Spectrom,18:652-656.
  [21]HORVATH T D,MATTHEWS N I,STRATTON SL,et al. Measurement of 3-hydroxyisovaleric acid inurine from marginally biotin-deficient humans byUPLC-MS / MS[J]. Anal Bioanal Chem,2011,401(9) :2805-2810.
  [22]BOGUSIEWICZ A,HORVATH T D,STRATTON SL,et al. Measurement of acylcarnitine substrate toproduct ratios specific to biotin-dependentcarboxylases offers a combination of indicators ofbiotin status in humans[J]. J Nutr,2012,142(9) :1621-1625.
  [23]HORVATH T D,STRATTON S L,BOGUSIEWICZA,et al. Quantitative measurement of plasma 3-hydroxyisovaleryl carnitine by LC-MS / MS as a novelbiomarker of biotin status in humans[J]. AnalChem,2010,82(10) :4140-4144.
  [24]HORVATH T D,STRATTON S L,BOGUSIEWICZA,et al. Quantitative measurement of urinaryexcretion of 3-hydroxyisovaleryl carnitine by LC-MS /MS as an indicator of biotin status in humans[J].Anal Chem,2010,82(22) :9543-9548.
  [25]MAEDA Y,ITO T,OHMI H,et al. Determinationof 3-hydroxyisovalerylcarnitine and other acylcarnitinelevels using liquid chromatography-tandem massspectrometry in serum and urine of a patient withmultiple carboxylase deficiency[J]. J Chromatogr BAnalyt Technol Biomed Life Sci,2008,870(2) :154-159.
  [26]MOCK D M,MOCK N I,STEWART C W,et al.Marginal biotin deficiency is teratogenic in ICR mice[J]. J Nutr,2003,133(8) :2519-2525.
  [27]ROSCHINGER W,MILLINGTON D S,GAGE D A,et al. 3-Hydroxyisovalerylcarnitine in patients withdeficiency of 3-methylcrotonyl Co A carboxylase[J].Clin Chim Acta,1995,240(1) :35-51.
 

推荐文章

在线客服系统