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乳铁蛋白对TLR2基因敲除小鼠体重和糖脂代谢变化及干预作用

更新时间:2020-11-27 08:22点击:

  摘    要:
  
  目的 观察Toll样受体2(toll like receptor 2, TLR2)基因敲除(TLR-2-)对小鼠体质量和糖脂代谢的影响及乳铁蛋白(lactoferrin, Lf)的干预作用。方法 20只雌性(8w龄)TLR-2-小鼠随机分为:TLR-2-小鼠喂饲普通饲料(TLR-2-+RC组)、TLR-2-小鼠喂饲添加2%Lf的饲料(TLR-2-+Lf组)2组,同时设置一组普通饲料喂养的同周龄TLR2野生型C57BL/6小鼠(WT组,n=10)。每周称量体质量和摄食量,结束实验前1 w测定空腹血糖和胰岛素水平,计算血糖曲线下面积(AUC)。干预16w后,小鼠禁食8h后测定空腹血糖及胰岛素并计算稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。检测血清总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。Western blot法测定小鼠肝脏中胆固醇调节元件结合蛋白2(SREBP-2)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和TLR4的表达。结果 干预16 w后,TLR-2-+RC组小鼠体质量显著高于WT组[(27.1±1.0)g vs.(23.8±0.7)g, P<0.05],Lf干预显著降低了TLR-2-小鼠的体质量[(25.1±1.5)g vs.(27.1±1.0) g, P<0.05)]。与WT组比较,TLR-2-+RC组小鼠空腹血糖和胰岛素耐量无显著性变化,血清TC及LDL-C则显著升高(P<0.05)。TLR-2-+Lf组小鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平显著低于TLR-2-+RC组(P<0.05)。TLR-2-+RC组小鼠肝脏SREBP-2和TLR4的表达均显著高于WT组小鼠,Lf干预显著下调了TLR-2-+Lf组小鼠肝脏SREBP-2和TLR4表达(P<0.05)。结论 TLR2基因敲除诱导了小鼠的肥胖和脂代谢紊乱。Lf干预改善了TLR-2-小鼠的糖代谢和血脂水平,下调肝脏TLR4表达,从而控制TLR-2-小鼠的体质量增加。[营养学报,2020,42(2):152-156]
  
  关键词:
  
  Toll样受体2 肥胖 乳铁蛋白
  
  Toll样受体家族(TLRs)是机体固有免疫的重要组成部分,TLR2可识别微生物病原相关分子模式,启动NF-κB炎症信号通路并释放炎症因子[1]。肥胖人群和代谢综合征人群腹部脂肪组织中有较高的TLR2表达水平[2]。抑制或敲除TLR2基因(TLR-2-)可抑制炎症反应,改善胰岛素抵抗(IR)进而改善慢性炎症引起的肥胖。但在动物实验中,TLR-2-对小鼠体质量影响的研究结果并不一致。TLR-2-可以改善小鼠IR和高脂饲料(HFD)引起的肥胖[3],Shechter等的研究则认为TLR-2-小鼠具有自发性肥胖趋势,且在HFD诱导下较TLR2野生型小鼠肥胖更加显著[4]。因此,TLR2敲除对肥胖的影响还需进一步的研究。
  
  乳铁蛋白(lactoferrin,Lf)是跨膜糖蛋白,具有广泛的生物活性,包括抗炎、抗菌及抗氧化作用[5-6]。Lf还能改善能量代谢和平衡,降低体质量,改善肥胖[7-8]。本研究观察TLR2基因敲除及在普通饲料喂养基础上添加Lf干预TLR-2-小鼠,对小鼠体质量的影响及其机制。
  
  1 材料与方法
  
  1.1 动物与分组
  
  10只8w龄雌性Balb/C小鼠及20只雌性TLR-2-小鼠(上海斯莱克实验动物)饲养于光/暗12 h/12 h、相对湿度40%-70%,室温18~22℃的SPF动物房内。适应性喂养1w后随机分成野生型小鼠(WT)、TLR-2-小鼠喂饲普通饲料(TLR-2-+RC)及TLR-2-小鼠喂饲添加2%Lf的饲料(TLR-2-+Lf)3组。小鼠普通饲料(上海斯莱克实验动物),牛Lf(美国Hilmar),Lf粉末与普通饲料按1:49均匀混合,压制成形并烘干。实验持续16 w。
  
  1.2 指标测定
  
  1.2.1 一般状况:
  
  每日观察小鼠毛色、饮水、饮食、排泄以及活动等基本情况,每周称体质量和摄食量。
  
  1.2.2 经腹糖耐量实验(IPGTT):
  
  实验结束前1w进行IPGTT。小鼠禁食10h后,腹腔注射葡萄糖溶液[1.5 g/(kg bw)],分别于注射前(0 min)、注射后30、60和120 min小鼠尾部采血,用罗氏全活力型血糖仪(ACCU-CHEK,ACTIVE德国罗氏)测量血糖水平,计算血糖曲线下面积(AUC)。
  
  1.2.3血液指标:
  
  小鼠恢复1w,于16 w结束实验。禁食10h后,次日眼球后静脉丛采血,立即用罗氏血糖仪测空腹血糖(FBG),剩余血液3500r/min离心15min收集血清-80℃保存。用ELISA试剂盒(美国Millipore Billerica)测定空腹胰岛素(FINS)水平,采用稳态模型评价IR(HOMA-IR),公式:HOMA-IR=FBG(mmol/L)×FINS(μmol/L)/22.5。同时使用试剂盒(南京建成)测定血清总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。
  
  1.2.4 肝脏脂代谢相关蛋白表达检测:
  
  称取小鼠肝脏组织,加入细胞裂解液,冰上裂解2h后碾磨,12000r/min离心15min,取上清用BCA测定蛋白浓度,调整样本浓度为2μg/μl,加缓冲液,95℃变性5min制样,-80℃保存备用。样本SDS-PAGE凝胶电泳后转至PVDF膜,用5%脱脂奶粉封闭换,室温下封闭1h。封闭后加入一抗ACC(Abcam,英国;1:1000),SREBP-2(Abcam;1:1000),TLR-4(Abcam;1:1000)和β-actin(Sata,美国;1:1000)4℃过夜,TBST清洗,加入过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(Jackson,美国,1:1000)孵育1 h。洗涤后加入辣根过氧化物酶HRP,用Gibox凝胶成像系统进行成像及图像分析。
  
  1.3 统计学分析
  
  所有数据以±s表示,用SPSS19.0软件进行单因素方差分析,SNK法进行两两比较,P<0.05为差异有统计学意义。
  
  2 结果
  
  2.1 TLR2基因敲除对小鼠体质量的影响及Lf的干预作用(图1)
  
  Fig.1 The weight changes of mice among different groups during experiment
  
  实验期间体质量从高到低依次是TLR-2-+RC组、TLR-2-+Lf组和WT组,实验结束时3组体质量分别为(27.1±1.0)g,(25.1±1.5)g和(23.8±0.7)g,TLR-2-+RC组小鼠体质量显著高于WT组(P<0.05),Lf干预则显著降低了TLR-2-小鼠的体质量(P<0.05)。实验期间3组小鼠的平均摄食量无显著性差异。
  
  2.2 TLR2基因敲除对小鼠血糖的影响及Lf的干预作用(图2)
  
  TLR-2-+RC组和TLR-2-+Lf组小鼠腹腔注射葡糖之后血糖波动低于WT组。与WT组比较,虽然TLR-2-+RC组的IPGTT-AUC降低,但无显著性差异。Lf干预后,TLR-2-小鼠的IPGTT-AUC进一步降低,显著低于WT组(P<0.05)。
  
  2.3 TLR2基因敲除对小鼠IR的影响及Lf的干预作用(表1)
  
  TLR-2-+RC组小鼠的FBG、FINS和HOMA-IR与WT组无显著差异,提示TLR2基因敲除未显著影响小鼠的糖代谢。Lf干预显著降低了TLR-2-小鼠以上指标(P<0.05),与IPGTT结果相一致。
  
  2.4 TLR2基因敲除对小鼠血脂的影响及Lf的干预作用(表2)
  
  Fig.2 Blood glucose change of IPGTT(A)and AUC(B)between groups
  
  与WT相比,TLR-2-+RC组血脂TC和LDL-C水平显著升高(P<0.05)。Lf干预显著降低了TLR-2-小鼠的TC、TG、HDL-C和LDL-C水平(P<0.05)。
  
  2.5 TLR2基因敲除对小鼠肝脏相关蛋白表达的影响及Lf的干预作用(图3)
  
  Fig.3 Effect of Lf supplementation on hepatic protein expression
  
  Fig.3 Effect of Lf supplementation on hepatic protein expression
  
  与WT比较,TLR-2-+RC组小鼠肝脏组织中SREBP-2和TLR-4的表达显著增加(P<0.05)。Lf干预显著降低了肝脏组织SREBP-2和TLR4的表达(P<0.05)。
  
  3 讨论
  
  本研究在普通饲料喂养情况下,TLR2基因敲除加重小鼠的肥胖,且TLR-2-小鼠血清TC和LDL-C水平、肝脏SREBP-2和TLR4表达显著升高。Rivera等观察到TLR2缺失增加了饮食诱导的非酒精性脂肪肝模型小鼠的肝脏脂质堆积[9],与本研究结果一致。TLR4也是外源性病原分子识别受体,可激活MyD88-NF-κB炎症信号通路,释放炎症因子,导致IR及肥胖。TLR2与TLR4之间可能存在补偿调节作用。Ding等观察到LDLR-/-小鼠敲除TLR4后腹部脂肪组织和肝脏组织TLR2代偿性表达增加。且TLR2敲除后,组织炎症因子水平和IR无明显改善[10]。本研究也观察到TLR2敲除后肝脏TLR4表达代偿性增加,而TLR4表达增加也可能进一步影响小鼠脂肪代谢。因此,TLR2基因缺失使小鼠肝脏脂质代谢受损,炎症水平提高,小鼠具有肥胖倾向。
  
  许多研究探讨牛奶蛋白对体质量的影响[11],牛奶蛋白质Lf在控制体质量方面的作用值得关注。目前动物实验往往采用HFD诱导肥胖观察Lf的作用,Xiong等发现Lf干预15w能显著降低HFD诱导的小鼠肥胖和内脏脂肪[12],但McManus等未观察到Lf对HFD诱导小鼠体质量和脂肪质量的影响[13]。本研究用普通饲料喂养TLR-2-小鼠诱导肥胖,并观察到Lf干预显著降低了小鼠的体质量。我们的另一项研究中,Lf干预未改善HFD喂养小鼠的体质量,但显著降低了小鼠OGTT曲线下面积,并降低肝脏脂肪合成酶和升高脂肪分解酶[14]。本研究中伴随着体质量降低,Lf干预改善了糖代谢和血脂水平,下调肝脏中SREBP-2和TLR4的表达,证明Lf干预对TLR2基因缺失型肥胖具有一定预防作用。Mohamed等给予肥胖的2型糖尿病患者Lf胶囊3个月,发现能显著改善患者体质指数、糖化血红蛋白和脂质水平,而且通过TLR4-NFκB-SIRT1通路发挥抗炎和免疫调节作用[15]。由于观察对象/动物模型和干预方式往往互不相同,而且肥胖相关的调控机制非常复杂,因此具体机制还需进一步研究。
  
  参考文献
  
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