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铁摄入量对小鼠棕色脂肪活性的影响

更新时间:2020-11-27 08:24点击:

  摘    要:
  
  目的 探讨铁摄入量对棕色脂肪活性的影响。方法 健康6 w龄雄性C57BL/6j小鼠30只,随机分为3组,分别给予正常(NI组:35 mg/100g)、低(LI组:4 mg/100g)、高(HI组:2000 mg/100g)铁饲料喂养8 w。8 w后取小鼠肩胛间区棕色脂肪组织进行线粒体呼吸功能检测、UCP-1蛋白质荧光共聚焦显像、免疫印迹检测、棕色脂肪产热相关基因qRT-PCR检测。结果 LI组棕色脂肪线粒体呼吸链复合物Ⅰ的态4呼吸速率(CI-LEAK)和复合物I+II的电子传递能力(CI+II-ETS)低于NI组(P<0.05)。HI组棕色脂肪线粒体呼吸链复合物Ⅰ的态4呼吸速率(CI-LEAK)、复合物II的电子传递能力(CII-ETS)、复合物I+II的态3呼吸速率(CI+II-OXPHOS)和电子传递能力(CI+II-ETS)均低于NI组(P<0.05)。HI组棕色脂肪标志性蛋白UCP-1及相关基因Ucp-1、Pgc-1α、Prdm16、Pparγ表达低于NI组(P<0.05)。结论 铁元素摄入过多或过少均能够对BAT及机体代谢不利影响。特别是过量摄入铁能够导致BAT功能明显退化,进而促进肥胖发生、葡萄糖耐量变差,是代谢性疾病的潜在危险因素。[营养学报,2020,42(2):162-166,172]
  
  关键词:
  
  铁 棕色脂肪 线粒体 解偶联蛋白1 肥胖 葡萄糖耐量
  
  随着人类经济生活方式的改变,肥胖、糖尿病等慢性代谢性疾病逐年增多,并严重威胁着人类的健康[1]。棕色脂肪组织(brown adipose tissue,BAT)是哺乳动物体内的特殊组织,其线粒体内膜上存在一种特殊的蛋白—解偶联蛋白1(uncoupling protein 1,UCP-1),UCP-1能够在不生成ATP的情况下直接氧化葡萄糖,使之以热能形式释放[2]。BAT的这种特殊功能在维持体温和抵抗代谢性疾病等方面有重要作用。铁是饮食中不可缺少的重要微量元素之一,在细胞呼吸和能量代谢等方面具有重要作用[3]。在食物匮乏的过去,缺铁导致的各种疾病曾一度成为我国最普遍的健康问题[4]。随着全球经济的持续发展,如今食物充足、来源丰富,瘦肉、动物内脏、蛋、海鲜等富含铁元素的食物已成为现代人餐桌上每日不可或缺的一部分[5]。但当铁的摄入量超过一定范围时,铁在体内贮留也会对多种组织器官造成损害[6]。研究证明过量摄入铁会诱发并加重糖尿病、并影响脂肪细胞的内分泌功能[7]。但目前国内外有关铁与BAT之间的关系的研究较少。本研究旨在探讨铁的摄入量对BAT活性的影响及其分子机制,为代谢性疾病的研究提供新思路。
  
  1 材料与方法
  
  1.1 仪器与试剂
  
  1.1.1 仪器:
  
  Oxygraph-2k高分辨线粒体呼吸测定仪(奥地利Oroboros);QuantStudio 5实时荧光定量PCR系统(美国Thermo);Amersham Imager 600数字图像检测分析仪(美国GE);激光共聚焦显微镜(德国Zeiss);NanoDrop 2000c超微量分光光度计(美国Thermo)等。
  
  1.1.2 试剂:
  
  小鼠饲料选自Teklad iron Diet(93G)系列(美国Evigo)。线粒体呼吸功能测定所用丙酮酸盐、谷氨酸盐、苹果酸、琥珀酸盐、二磷酸腺苷、鱼藤酮、细胞色素C等(美国Sigma)。Anti-UCP1(美国Abcam)、Anti-α-Tubulin、Anti-HRP-IgG、DAPI染色液、RIPA、PMSF(上海Beyotime)。BCA微量蛋白定量试剂、ECL显色液(美国Thermo)。RNA simple总RNA提取试剂盒、FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂、荧光定量PCR预混试剂SuperReal PreMix Plus(北京TIANGEN)。氯仿、无水乙醇、二甲苯、石蜡等其他常规实验试剂(国内化学试剂公司)。
  
  1.2 方法
  
  1.2.1 动物饲养及取材:
  
  健康雄性6 w龄C57BL/6J小鼠30只(北京Charles River),适应性喂养1 w后随机分为3组,每组10只,分别给予低铁(LI:4 mg/100g)、正常铁(NI:35 mg/100g)、高铁(HI:2000 mg/100g)饲料喂养8 w。小鼠饲养于(25±2)℃恒温、恒湿环境,12h/12h昼夜节律,自由进食、饮水。所选低铁饲料含铁量能够满足小鼠每日所需最低量,高铁饲料铁含量在毒性范围内,能够保证小鼠正常生理状态[8]。
  
  监测小鼠一般状态、进食量及体重并测量血常规以确保血红蛋白在正常水平。8 w后断尾采血法行腹腔注射葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucose tolerance test,iGTT)。禁食8 h后测空腹血糖记为0 min,并以1.5 g/kg腹腔注射葡萄糖溶液,注后15、30、60、120 min分别测量血糖浓度。处死小鼠后迅速进行BAT线粒体功能测量及取样,所取组织部分放入液氮并储存于-80℃冰箱,另一部分置于4%多聚甲醛中以备后续实验。
  
  1.2.2 线粒体呼吸功能测定:
  
  新鲜BAT迅速置于冰上,称干重5 mg后放入预冷的呼吸液中匀浆。将底物与各呼吸链相关酶抑制剂、解偶联剂先后加入系统中,并监测系统氧耗量[pmol/(s·mg)],通过后处理系统分别得到BAT线粒体呼吸链复合物Ⅰ的态3、态4呼吸速率(CI-OXPHOS/CI-LEAK)、复合物II的电子传递能力(CII-ETS)、复合物I+II的态3呼吸速率(CI+II-OXPHOS)和电子传递能力(CI+II-ETS)。测定期间系统内加入细胞色素C,对线粒体膜完整性进行质控。
  
  1.2.3标志蛋白UCP-1表达量测定
  
  荧光共聚焦显像:小鼠BAT经过4%多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋、5μm连续切片、梯度酒精脱蜡、漂洗后加入小牛血清封闭1h,滴加Anti-UCP1(1:100),4℃湿盒孵育12h,洗片后再次封闭1h,滴加荧光二抗室温避光孵育2 h,DAPI染色、洗片、封片、激光共聚焦显微镜成像。
  
  蛋白质免疫印迹(Weston blot):取BAT100 mg,加入500μl组织裂解液(RIPA+1%PMSF)充分研磨裂解,利用BCA组织蛋白定量法测定总蛋白含量。配制5%/10%SDS-PAGE凝胶,每孔上样50μg,80V 30 min/120V 60 min垂直电泳,200 mA 60 min湿法转膜,5%脱脂牛奶封闭2 h,一抗4℃孵育12 h、二抗室温孵育2 h,洗膜后滴加ECL显影液进行曝光。
  
  1.2.4 棕色脂肪产热相关基因实时荧光PCR(qRT-PCR):
  
  BAT 100 mg,离心柱法提取总mRNA。经过裂解、抽提、漂洗、洗脱等步骤得到BAT总mRNA并测定浓度及纯度,确保提取mRNA浓度大于100 ng/μl且无DNA及蛋白质残留。调整总mRNA浓度为100 ng/µl,取6µl加入反转录体系(20µl)。加入预混试剂(包含酶、随机引物、Oligo dT primer和dNTP)4µl及无RNA酶超纯水10µl。反应条件:反转录42℃,15 min;酶灭活95℃,3 min。将反转录所得cDNA进行20倍稀释后取2µl加实时荧光定量PCR反应体系(嵌合荧光法、20µl)另外体系中加入10µl的预混试剂PreMix(包含酶、dNTP、SYBR Green I),上、下游引物各0.6µl(表1),1µl的50×ROX,每样本3次重复。反应条件:预变性95℃,15 min;变性95℃,10 s;退火60℃,20 s;延伸72℃,32s,40个循环。反应结束后进行溶解曲线分析,内参选择18S RNA,对照组为NI组,利用2–ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。
  
  1.3 数据分析与统计方法
  
  选用Image J软件对蛋白电泳及免疫荧光图像进行定量分析;Primer Premier在线工具设计引物序列;QuantStudio™Design&Analysis软件对PCR结果进行质控和数据分析;Graphpad Prism 6软件对所得数据进行统计分析计量资料用±s表示,组间比较采用One-Way ANOVA,两两比较用独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
  
  2 结果
  
  2.1 小鼠一般情况(表2,图1)
  
  饲养至第3 w时,LI组小鼠毛色较其他两组略暗淡,HI组与NI组比较外观无明显差异。造模期间3组进食量无明显差异,血红蛋白均在正常范围内。3组间比较,LI组体质量、血红蛋白低于NI组,HI组高于NI组,差异有统计学意义,F=18.77、15.24,P<0.05。以NI为对照组比较iGTT,曲线下面积(area under curve,AUC)HI组高于NI组t=4.821 P<0.05,LI组和NI组比较无差异。
  
  Fig.1 The result of iGTT
  
  a P<0.05,n=5,unpaired t test
  
  2.2 线粒体呼吸功能(表3、图2)
  
  三组线粒体呼吸功能对比,CI-LEAK、CI+II-OXPHOS、CI+II-ETS、CII-ETS有差异,P<0.05,F值分别为7.829、6.549、10.42、8.67。以NI为对照组进行独立样本t检验,LI组CI-LEAK和CI+II-ETS低于NI组,t=2.86和3.93 P<0.05。HI组CI-LEAK、CI+II-OXPHOS、CI+II-ETS和CII-ETS低于NI组,P<0.05,t值分别为:3.45、4.59、7.23和5.76。
  
  2.3 标志性蛋白UCP-1表达量(图3,4)
  
  荧光共聚焦显像示:HI组脂肪细胞内脂滴较NI组增大,红色荧光明显变浅。以NI为对照组,荧光共聚焦和免疫印迹结果均显示HI组小鼠BAT标志性蛋白UCP-1表达较NI组明显降低,P<0.05,LI组无差异。
  
  Fig.2 The results of mitochondrial respiration
  
  Fig.3 Analysis of BAT UCP-1 expression by immunofluorescence confocal imaging
  
  Fig.4 Western blot analysis of UCP-1 in BAT
  
  2.4 产热相关基因表达量(图5)
  
  以NI为对照组,HI组Ucp-1、Pgc-1α、Prdm16、Pparγ表达量低于对照组,差异有统计学意义,P<0.05,t值分别为:5.75、5.02、6.86、3.06。LI组与NI组比较无差异。
  
  Fig.5 The relative expression level of thermogenesis related genes
  
  3 讨论
  
  本研究观察到,铁摄入不足和过量均会对BAT产生不利的影响,特别是铁摄入过量有小鼠体质量增加、胰岛素抵抗、BAT细胞内出现大量脂质沉积,线粒体呼吸速率、电子传递能力和解偶联力、产热相关基因及标志性蛋白UCP-1表达减低等。在取材阶段,HI组小鼠BAT颜色较深,线粒体功能测定时BAT较多的线粒体膜破坏。以往研究表明,氧自由基(ROS)与柠檬酸盐或二磷腺苷复合能够导致线粒体呼吸链功能受损,并且UCP-1的上游关键基因PGC-1α的启动子序列内存在铁反应元件(iron-response element,IRE),在过量铁存在下,BAT组织产热相关基因表达下降,功能受损,KK/HIJ(KK)的肥胖小鼠伴随血清铁升高[9],并且铁调素(hepcidin)升高导致铁过量蓄积的小鼠出现胰岛素抵抗及高甘油三脂等[10]。过量的铁蓄积还能够降低线粒体mitoNEET表达水平[11],这与棕色脂肪形态学改变和线粒体复合物I+II的电子传递能力(CI+II-ETS)损害及产热相关基因表达受抑制的结果相一致。提示可能是高铁组BAT内存在铁沉积,不稳定铁池内过剩三价铁导致细胞乃至线粒体内存在较多的ROS,线粒体功能受到损害,产热相关基因表达降低,因此BAT活性减低,对糖、脂的处理能力下降,脂质沉积于细胞内部,出白色化表型。
  
  而LI组和NI组BAT在形态学、产热相关基因和UCP-1表达量等方面均未见明显差异。但LI组呼吸链复合物Ⅰ的态4呼吸速率(CI-LEAK)和复合物I+II的电子传递能力(CI+II-ETS)降低。由于本实验采用的低铁饮食是生理剂量,因此排除线粒体呼吸复合体功能受损。可能是低铁导致了线粒体呼吸链及电子传递链中铁依赖性组分的电子泄漏导致了氧化损伤,铁在BAT激活等方面具有重要作用[12],并且Galmozzi等研究证明,孕酮受体膜组分2(progesterone receptor membrane component 2,PGRMC2)是铁进入脂肪组织的关键分子之一,脂肪特异性PGRMC2缺失小鼠线粒体严重损伤,不能激活适应性产热[13]。
  
  综上,日常饮食中过多或多少摄入铁元素均能够对BAT及机体代谢不利影响。特别是过量摄入铁能够导致BAT功能明显退化,导致肥胖、葡萄糖耐量变差等,是代谢性疾病的重要潜在危险因素。
  
  参考文献
  
  [1] Vandevijvere S, Kraak V. Future directions to prevent obesity within the context of the global syndemic[J].Obesity Rev, 2019,20:3-5.
  
  [2] Lizcano F. The beige adipocyte as a therapy for metabolic diseases[J]. Int J Mol Sci, 2019,20:50-58.
  
  [3]纪立农,张放.铁代谢异常对糖代谢和糖化血红蛋白的影响[J].中国糖尿病杂志,2017,25:765-767.
  
  [4] Lynch SR. Why nutritional iron deficiency persists as a worldwide problem[J]. J Nutr,2011,141:763S.
  
  [5] Seiwert N, Heylmann D, Hasselwander S, et al. Mechanism of colorectal carcinogenesis triggered by heme iron from red meat[J]. Biochim Biophys Acta Rev Cancer,2020,1873:188334.
  
  [6] Sousa L, Oliveira MM, Túlio C. Pessôa M, et al. Iron overload:effects on cellular biochemistry[J]. Clin Chim Acta, 2019,11:029.
  
  [7] Blankenhaus B, Braza F, Martins R, et al. Ferritin regulates organismal energy balance and thermogenesis[J]. Mol Metab, 2019, 24:64-79.
  
  [8] Gao Y, Li Z, Gabrielsen, JS, et al.Adipocyte iron regulates leptin and food intake[J]. J Clin Invest,2015, 125:3681-3691.
  
  [9] Ma X, Pham VT, Mori H, et al. Iron elevation and adipose tissue remodeling in the epididymal depot of a mouse model of polygenic obesity[J], PLoS One, 2017,12:e0179889.
  
  [10] Dongiovanni P, Ruscica M, Rametta R, et al. Dietary Iron overload induces visceral adipose tissue insulin resistance[J]. Am J Pathol, 2013, 182:2254-2263.
  
  [11] Xiong W, Zhao X, Garcia-Barrio MT, et al. MitoNEET in perivascular adipose tissue blunts atherosclerosis under mild cold condition in mice[J]. Front Physiol,2017, 8:1032.
  
  [12] Min, SY, Desai A, Yang Z, et al. Diverse repertoire of human adipocyte subtypes develops from transcriptionally distinct mesenchymal progenitor cells[J]. Proc Nat Acad Sci, 2019, 116:17970.
  
  [13] Galmozzi A, Kok BP, Kim AS, et al. PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function[J]. Nature, 2019, 576:138-142.

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