27医学论文范文网

主页
分享医学论文范文

杨梅素对环磷酰胺致小鼠肝损伤的保护作用及机制探讨

更新时间:2020-11-27 08:25点击:

  摘    要:
  
  目的 探讨杨梅素对环磷酰胺致小鼠肝损伤的保护作用及其可能的作用机制。方法 采用连续7d腹腔注射环磷酰胺(50 mg/kg)建立小鼠肝损伤模型,随后连续30 d分别灌胃杨梅素(100、200、400 mg/kg)进行药物干预。取材后计算小鼠的肝指数;检测各组小鼠血清中血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性;肝组织中还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)及一氧化氮(NO)含量;酶联免疫吸附法(ELISA)检测肝组织匀浆中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、核因子kb(NF-kb)、白介素-1β(IL-1β)的表达情况;蛋白质免疫印迹法(Westernblot,WB)检测肝组织Bax、Caspase-3蛋白的表达。结果 与模型组比较,杨梅素中、高剂量组肝指数降低,血清AST、ALT活性降低,肝组织中GSH含量增加,MDA、TNF-α、NF-kb、IL-1β、NO含量均不同程度降低,WB结果显示Bax、caspase-3表达显著下调。结论 杨梅素对环磷酰胺诱导小鼠肝损伤有一定保护作用,其机制可能与抗氧化应激、抗炎和抗肝细胞凋亡有关。[营养学报,2020,42(2):178-182]
  
  关键词:
  
  杨梅素 环磷酰胺 肝损伤 保护作用
  
  环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)为广谱抗肿瘤药物,也是目前应用最多的免疫抑制剂之一。CTX在肝脏中转化为磷酰胺氮芥和丙烯醛,前者发挥抗肿瘤和免疫抑制作用,后者是引起肝脏等组织器官毒性症状的原因[1-2]。腹腔注射CTX致肝损伤模型已被大量应于评价受试物的肝保护作用[3]。杨梅素是药物化学的重要天然产品,属于黄酮类化合物,主要存在于藤茶茎叶或杨梅树皮和树叶中,已有研究显示其具有抗炎、抗肿瘤、抗疲劳等多种作用[4-6],但未见杨梅素对环磷酰胺致肝损伤小鼠的保护作用相关报道。本实验研究杨梅素对环磷酰胺诱导的小鼠肝损伤的影响,并探讨其可能的作用机制,以为其临床应用提供实验依据。
  
  1 材料与方法
  
  1.1 材料
  
  1.1.1 动物:
  
  ICR小鼠,SPF级,雌雄各半,18~22g,(长春市亿斯实验动物),常规饲养,自由饮水和进食。
  
  1.1.2 药品试剂:
  
  杨梅素(质量分数98%),批号:WZ16025,(西安万滋);CTX(质量分数≥98%,北京华迈科生物),批号:CO79504;谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、微量还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、,(南京建成);核因子kb(NF-kb)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)ELISA试剂盒(上海恒远生物);一氧化氮(NO)测定和Bradford蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天)。Bax、caspase-3、β-actin抗体(武汉爱博泰克),BCA蛋白定量测定试剂盒(北京鼎国昌盛,用于WB蛋白定量测定)。
  
  1.1.3 仪器:
  
  SC-3612低速离心机(安徽中科中佳);T10分散机(basic ULTRA-TURRAX,德国IKA);HPX-9272MBE电热恒温培养箱(上海博讯实业);722可见分光光度计(上海欣茂);-80°低温冰箱(中科美菱);BioTek ELX800酶标仪(美国博腾);上海天能5200成像发光系统(上海天能)。
  
  1.2 方法
  
  1.2.1 实验分组、给药和取材:
  
  健康级ICR小鼠60只,体质量18~22 g,随机分为:对照,模型,杨梅素低、中、高剂量共5组,每组12只。除对照组外,各组均腹腔注射CTX 50 mg/kg·d,连续7d,对照组同时给予等体积生理盐水腹腔注射,杨梅素各组自造模2d开始灌胃给药,低、中、高剂量组分别为100、200、400 mg/(kg·d),每日1次,连续30d,对照组和模型组每日灌胃等体积的0.25%羧甲基纤维素钠溶液。末次给药后禁食不禁水24 h,小鼠称体质量后给予10%水合氯醛(0.3 ml/kg)麻醉,腹主动脉取血,离心后取血清放-20℃冰箱保存,随后快速取肝,迅速用分析天平称质量、记录肝湿质量,称重后肝左叶立刻做10%肝组织匀浆并与肝右叶一同冻存于-80℃低温冰箱。
  
  1.2.2 指标测定:
  
  肝指数=肝重/体重(mg/g);按试剂盒说明书进行AST、ALT、GSH、MDA、NO、NF-kb、TNF-α、IL-1β含量测定。
  
  1.2.3 Western blot:
  
  检测肝组织中Bax和caspase-3表达,取20 ml冻存肝组织,提取总蛋白,采用BCA法进行蛋白含量测定,后经蛋白变性过程,加入SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白样品,转膜,封闭,抗β-actin、Bax、caspase-3的一抗(1:1000)稀释,4℃孵育过夜,洗膜3次,二抗(1:2000)孵育1 h,洗膜3次后曝光显影,内参蛋白β-actin为参照,对Bax和caspase-3蛋白表达量进行分析,计算目的蛋白与内参灰度比值。
  
  1.3 统计学方法
  
  采用SPSS 16.0统计学软件进行分析,数据以±s表示计量数据比较用方差分析;计数资料的比较用χ2检验,P<0.05表示差异有统计学意义。
  
  2 结果
  
  2.1 杨梅素对小鼠肝指数的影响(图1)
  
  与对照组比,模型组小鼠的肝指数明显增高(P<0.01),说明环磷酰胺可能造成了小鼠的损伤。与模型组比,杨梅素低剂量组小鼠实验后肝指数也有降低的趋势,但无统计学意义;而杨梅素中、高剂量组经药物干预后的小鼠肝指数均显著降低(P<0.05)。提示杨梅素可能对CTX肝毒性存在相互抵抗作用。
  
  2.2 杨梅素对小鼠血清AST和ALT活性的影响(图2)
  
  血清生化指标结果显示,与对照组比较,模型组小鼠AST、ALT活性均显著升高(P<0.05,P<0.01),说明CTX所致肝损伤造模成功。相比于模型组,AST、ALT在各给药组逐渐恢复,如杨梅素各组AST活性均显著降低(P<0.05),杨梅素中、高剂量组ALT活性显著降低(P<0.05),直接说明了杨梅素对于CTX所致肝损伤有一定保护作用。
  
  Fig.1 Effect of myricetin on the liver index in mice
  
  Fig.2 Effects of myricetin on serum AST and ALT in mice
  
  2.3 杨梅素对小鼠肝组织GSH、MDA和NO含量的影响(图3)
  
  10%肝组织匀浆生化指标显示,与空白对照组比,模型组GSH含量显著降低(P<0.01),MDA和NO含量都显著增加(P<0.01),与模型组比,杨梅素各剂量组小鼠肝组织中MDA和NO含量均不同程度降低(P<0.05,P<0.01),中、高剂量组GSH含量显著升高(P<0.05,P<0.01)。说明CTX所致肝损伤造模成功,杨梅素对于CTX所致肝损伤有一定保护作用,但以上保护机制仍需要进一步的实验证明。
  
  Fig.3 Effects of myricetin on hepatic GSH,MDA and NO content in mice
  
  2.4 ELISA法检测杨梅素对小鼠肝组织NF-kb、TNF-α和IL-1β含量的影响(图4)
  
  与对照组比,模型组NF-kb、TNF-α和IL-1β含量显著增加(P<0.01);与模型组比,杨梅素中、高剂量组NF-kb、TNF-α和IL-1β含量均明显降低(P<0.05,P<0.01),表明杨梅素可明显减轻肝损伤导致的炎症反应。
  
  2.5 杨梅素对小鼠肝细胞凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3表达的影响
  
  Western blot结果所示,与空白对照组比较,模型组Bax和Caspase-3蛋白表达显著增加(P<0.01),与模型组比,杨梅素中、高剂量组Bax和Caspase-3蛋白表达不同程度的显著降低(P<0.05,P<0.01)。结果表明杨梅素可以抑制CTX诱导的细胞凋亡,杨梅素对CTX所致肝损伤小鼠的保护作用机制可能与下调凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3的表达有关。
  
  Fig.4 Effects of myricetin on the levels of hepatic NF-kb,TNF-αand IL-1βin mice detected by ELISA
  
  Fig.5 Effect of myricetin on the expression of apoptosis related proteins Bax and caspase-3 in mouse liver
  
  3 讨论
  
  CTX具有广泛的抗肿瘤活性,CTX能够引起血清和肝组织中生化指标的显著变化,造成肝组织损伤,因此,研究各种可以降低或拮抗CTX毒副作用的药物,具有十分重要的意义[7]。杨梅素是一种天然多羟基黄酮类单体化合物,是从天然植物藤茶、杨梅等树皮中提取得到的,主要存在于杨梅树皮中。已有研究表明杨梅素及其衍生物具有如抗肿瘤、降血糖、影响淋巴细胞活化和增殖、拮抗血小板活化因子(RAF)、镇痛、抗氧化抗衰老等多种药理活性[8]。本研究,首先通过计算和比较小鼠的肝指数发现,CTX能显著地增大正常小鼠的肝指数,而杨梅素中、高剂量组可显著降低肝脏指数,初步推测了杨梅素对抗环磷酰胺导致的肝损伤。随后,测定各组小鼠血清中ALT和AST活性,二者均为肝损伤的标志酶[9],结果发现杨梅素三剂量组均可降低AST活性,中、高剂量组可显著降低ALT活力,直接验证了杨梅素对于CTX所致肝损伤的抵抗作用。
  
  肝组织匀浆GSH的测定结果表明杨梅素可使其含量增高,可能通过减少脂质过氧化及GSH的消耗来缓解CTX所致肝损伤。氧化应激是CTX诱导肝损伤的主要原因之一,MDA作为脂质过氧化的代谢产物,其含量的变化间接反映了组织中氧自由基含量变化。而CTX代谢产物丙烯醛还会干扰体内的抗氧化系统,导致肝细胞损伤甚至死亡。从肝组织匀浆的生化指标测定结果可以看出,与模型组比较,杨梅素组小鼠肝组织内的MDA含量显著下降,,抑制了CTX毒性代谢途径及其所致的氧化应激反应,最终发挥保肝作用[10]。NO也是氧化应激损伤产生的主要自由基之一,是肝细胞氧化还原生物学中至关重要的活性氮[11]。杨梅素可使肝损伤的敏感指标GSH、MDA和NO较模型组均有明显改善,说明其可能通过下调氧化应激水平来实现对肝损伤的保护作用。在CTX的作用下,肝脏中炎症因子TNF-α、IL-1β的水平会明显升高。炎症因子的积聚进一步加剧了CTX诱导的肝损伤[12]。NF-κB可诱导炎性因子的合成和释放,从而在感染、细胞损伤等病理过程中发挥关键作用[13]。杨梅素通过阻止NF-κB核因子激活,抑制炎性反应级联放大的触发机制。在本研究中,杨梅素可显著下调模型小鼠肝组织中TNF-α、IL-1β、NF-κB的含量,抑制炎症反应的发生。
  
  Bax和Caspase-3均为促凋亡蛋白。Caspase-3是凋亡过程中的关键酶,在凋亡信号传导中常作为公共凋亡效应分子发挥最后的枢纽作用。当细胞受到损伤、增殖活性受到抑制或发生细胞凋亡时,Caspase-3蛋白表达水平均可升高[14-15]。本实验发现Bax和Caspase-3的表达在模型组高于空白对照组,而相比于模型组组,在杨梅素中、高组中显著下调。杨梅素的干预显著抑制了由CTX所致的肝细胞凋亡相关的蛋白表达,可逆转四氯化碳诱导急性肝损伤小鼠细胞凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3表达的异常。这可能是杨梅素抵抗CTX肝脏损伤的直接原因。
  
  综上,本研究初步验证了杨梅素对于CTX致肝损伤的保护作用,其中、高剂量组可以达到非常好的护肝效果,且呈现剂量依赖性。其保肝机制可能涉及到抗氧化应激、抗炎以及抑制肝细胞凋亡等。这也初步体现出杨梅素抵抗CTX肝毒性可能存在类似中药或其他天然产物的多靶点的作用模式。有关杨梅素的保肝作用机制研宄仍需要进一步深入探讨。
  
  参考文献
  
  [1]黄银燕,杨翠玲,李伟东,等.乌贼墨提取物对环磷酰胺致肝损伤小鼠肝功能的保护作用研究[J].食品研究与开发,2010, 31:13-16.
  
  [2]邵颖,陈安徽,张明,等.蛹虫草速溶粉对环磷酰胺致小鼠肝损伤的保护作用[J].食品工业科技, 2018, 39:290-294.
  
  [3] Hauck AK, Bernlohr DA. Oxidative stress and lipotoxicity[J]. J Lipid Res, 2016, 57:1976-1986.
  
  [4]侯小龙,王文清,施春阳,等.二氢杨梅素药理作用研究进展[J].中草药,2015,46:603-608.
  
  [5]杨秀芬,扬子明.二氢杨梅素对小鼠肝脏谷胱甘肽-S-转移酶的抑制作用及其动力学分析[J].中国药理学通报,2010,26:894-898.
  
  [6]屠梦珏,魏进歌,陈鑫,等.二氢杨梅素对APAP诱导小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中国药理学通报,2018,34:1707-1712.
  
  [7] Chen SH, Zhao XL, Wan J, et al. Dihydromyricetin improves glucose and lipid metabolism and exerts anti-inflammatory effects in nonalcoholic fatty liver disease:a randomized controlled trial[J]. Pharmacol Res,2015,99:74-81.
  
  [8]张秀娟,黄清玲,季宇彬.杨梅素的药理活性研究进展[J].天津药学,2008,20:57-59.
  
  [9]李志满,邵紫君,李珊珊,等.人参枳椇子提取物对小鼠酒精性肝损伤的保护作用[J].食品工业科技,2019,40:302-306,313.
  
  [10] Ni HM,Mitchell RM,Chao XJ,et al.Removal of acetaminophen-protein adducts by autophagy protects against acetaminophen-induced liver injury in mice[J]. J Hepatol,2016,65:354-362.
  
  [11] Diesen DL,Kuo PC. Nitric oxide and redox regulation in the liver:partⅡ.redox biology in pathologic hepatocytes and implications for intervention[J]. J Surg Res,2011,167:96-112.
  
  [12] Lin LC,Zhao FF,Wang M,et al. Protection of auriculatone sulphate against APAP-induced acute liver injury in mice[J].Nat Prod Res Dev,2018,30:761-766.
  
  [13]张娜,赵良友,毛迪,等.刺五加多糖调控炎性因子对小鼠免疫性肝损伤的保护作用[J].中国中药杂志,2019,44:2947-2952.
  
  [14] He X,Sun J,Huang X. Expression of Caspase-3,Bax and Bcl-2 in hippocampus of rats with diabetes and subarachnoid hemorrhage[J]. Exp Ther Med,2018,15:873-877.
  
  [15]董雅洁,高维娟. bcl-2,bax,caspase-3在细胞凋亡中的作用及其关系[J].中国老年学杂志,2012,32:4828-4830.

推荐文章