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非转基因和转基因大豆中氨基酸含量的分析

更新时间:2020-12-07 08:25点击:

  摘    要:
  
  目的 本实验对大豆中氨基酸分析的酸水解方法进行研究,比较非转基因和转基因大豆中氨基酸的含量。方法 样品用含0.1%巯基乙酸的盐酸溶液水解提取,样液经定容、过滤、浓缩、复溶、过膜后,用氨基酸分析仪测定,外标法定量。结果 本实验应用含巯基乙酸的盐酸水解液对大豆样品进行水解的同时有效防止了蛋氨酸的氧化,方法的回收率为93%~96%,相对标准偏差小于4.6%。非转基因和转基因大豆样品的16种氨基酸分析,转基因大豆中的氨基酸含量均不低于非转基因大豆。结论 该方法准确快速、重现性好,适用于大豆中氨基酸含量分析的检测要求,转基因大豆氨基酸含量不低于非转基因大豆。[营养学报,2020,42(3):287-290]
  
  关键词:
  
  氨基酸 大豆 转基因 非转基因 氨基酸分析仪
  
  大豆[Glycine max(L.)Merr]是豆类植物中营养价值较高的作物[1],富含优质的蛋白质和大量人体必需的氨基酸,其中赖氨酸、亮氨酸、精氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸含量较高,能满足人类健康所需的均衡营养,具有很好的发展前景[2]。挑选品质优良的大豆品种对我国保种、遗传育种和营养工作有着重要的意义,转基因大豆自诞生之日起,其安全性评价便广受关注[3]。联合国粮农组织(FAO)、世界卫生组织(WHO)、经济合作与发展组织(OECD)、国际生命科学学会(ILSI)均先后对该评价工作付出了不同程度的努力,抗虫、抗病等转基因大豆的研究取得一定进展[4-6]。组成蛋白质的氨基酸在大豆的营养品质方面起着重要作用,准确、高效地检测大豆氨基酸组分的含量,是大豆品质分析的重要研究方向。由于多数氨基酸无紫外吸收和荧光发射特性,需通过衍生化后进行检测[7]。国内外许多学者对其进行研究,开发出柱前衍生的高效液相色谱法[8-11]、液相色谱-质谱联用法[12-14]、阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法等[15]。氨基酸分析仪是氨基酸分析专用仪器,采用柱后用茚三酮衍生的阳离子交换色谱法,该方法准确可靠、重现性好[16]。
  
  本实验使用氨基酸分析仪,对其前处理过程进行优化,建立了更加准确快速的大豆中氨基酸含量分析的检测方法。通过对不同实验基地的非转基因和转基因大豆样品的测定,分析其所含的氨基酸成分和含量,为进一步科学认识转基因和非转基因大豆中的氨基酸提供一定的依据。
  
  1 材料与方法
  
  1.1 材料与试剂
  
  大豆样品:原料样品用四分法缩减,粉碎备用。样品编号1-6,其中1、2、3为非转基因大豆(中黄10-A,B,C),4、5、6为转基因大豆(2H10-6-A,B,C),2H10-6大豆是通过向大豆中黄10品种中转入双价基因G2-EPSPS基因和GAT基因获得的。抗除草剂特性的形成与植物体内草甘膦的降解和EPSP酶对草甘膦的敏感性有关。植物本身的EPSP酶对草甘膦非常敏感,它的功能可被草甘膦强烈抑制,在草甘膦处理条件下植物体由于不能合成芳香族氨基酸致死。G2-EPSPS基因编码一种不被草甘膦抑制的EPSP酶,通过转基因,在草甘膦存在下它能在植物体内代替本身的EPSPS基因执行功能,使植物免受草甘膦的伤害。GAT基因可以在植物体内降解草甘膦。因此转G2-EPSPS和GAT基因大豆可大幅度提高对草甘膦除草剂的耐受性。A、B、C代表北京、石家庄、三亚三个不同的种植基地。
  
  16种氨基酸标样:日本和光公司;盐酸(优级纯):北京试剂公司;巯基乙酸:美国Sigma公司;氨基酸分析仪配套的流动相(茚三酮溶液和缓冲液):日本和光公司。
  
  1.2 仪器和设备
  
  L-8900型氨基酸分析仪(日本日立);电热恒温干燥箱(上海森信);浓缩仪(东京理化);自动凯氏定氮仪(FOSS公司)。
  
  1.3 方法
  
  1.3.1 蛋白质含量的测定:
  
  称取约0.20 g样品,加入4.5 ml浓硫酸和催化剂片(K2SO4 1.5g;Se0.0075g),过夜,同时做样品空白管。次日,置凯氏消化器消化6h,待消化完全后用自动定氮分析仪测定氮含量[17]。
  
  1.3.2 氨基酸样品预处理:
  
  称取样品约0.10g于水解管中,在水解管内加6 mol/L盐酸(含0.1%巯基乙酸)15 ml,再将水解管放入冷冻剂中,冷冻3~5 min,再接到真空泵的抽气管上,抽真空,然后充入高纯氮气;在充氮气状态下封口,将已封口的水解管放在(110±1)℃的恒温干燥箱内,水解22 h后,取出冷却。
  
  打开水解管,将水解液全部转移到50ml容量瓶内,用去离子水定容,多次冲洗水解管。将水解液过滤后,吸取滤液1 ml于10 ml管中,用真空浓缩器在50℃左右抽干,残留物用1~2 ml水溶解,最后蒸干,用2.0 ml 0.02 mo L/L稀盐酸溶解,过滤后供仪器测定。
  
  1.3.3 色谱条件:
  
  色谱柱:PH水解氨基酸柱,4.6 mm×60 mm,3μm;检测波长:570nm,其中脯氨酸检测波长为440 nm;分析柱温度:57℃;反应柱温度:135℃;进样体积:20μl;洗脱溶液流速为:0.4 ml/min;柱后衍生试剂流速为:0.35 ml/min。
  
  2 结果与分析
  
  2.1 蛋白质含量(表1)
  
  2.2 氨基酸测定结果
  
  2.2.1 方法色谱条件选择(图1):
  
  茚三酮衍生的阳离子交换色谱法,吸取标准储备溶液,用0.0 2 m o l/m l稀盐酸配制混合标准溶液(0.10μmol/ml)。从图中可以看出,峰窄而尖,基线平稳,分离效果好,在实际样品中,目标峰也与样品中的其他杂质峰分离良好,该方法准确可靠、重现性好。
  
  2.2.2 方法的精密度:
  
  取同一批样品6份,按上述前处理过程做精密度试验,结果显示,相对标准偏差(RSD)小于4.6%,表明此检测方法重复性较好。
  
  Fig.1 chromatograms of 16 amino acids in soybeans
  
  2.2.3 方法的检出限与定量限:
  
  在上述分析条件下,结合取样量和复溶后定容的体积,以3倍信噪比计算检出限(LOD),10倍信噪比计算定量限(LOQ)(表2)。
  
  2.3 水解方法对氨基酸检测结果的影响(表3)
  
  蛋氨酸为含硫氨基酸,在酸水解过程中,植物性蛋白质样品因容易被氧化而导致检测值比实际含量值偏低,因此蛋氨酸回收率的提高是保证水解氨基酸检测结果准确的关键。
  
  表3列出三种不同的的前处理酸水解方法对样品进行添加回收的比较实验结果,加入含0.1%巯基乙酸的盐酸水解法对样品中蛋氨酸的水解效果较好。由于加入的巯基乙酸既具有羟酸的反应特征,又具有巯基的反应特征,直接对大豆样品进行水解的同时,可有效防止样本中蛋氨酸的氧化,减少了前处理过程中的氧化损失。加入巯基乙酸的盐酸水解液,分析步骤相对简单,重现性好,节省前处理时间,回收率高。色氨酸是碱性状态下稳定存在的氨基酸,本研究所建立的前处理方法是酸性环境,色氨酸因在此前处理过程中被破坏,故不能被检测分析。
  
  2.4 样品检测结果(表4)
  
  本研究通过氨基酸分析仪对来自三个转基因农作物实验基地的非转基因受体大豆和同型转基因大豆样品中的16种氨基酸进行分析,两组均值比较采用t检验,检验水准α=0.05,统计结果见表4。转基因和非转基因大豆中苏氨酸,甘氨酸,蛋氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,酪氨酸及赖氨酸差异无统计学意义(P>0.05)。转基因大豆中天冬氨酸,丝氨酸,丙氨酸,谷氨酸,缬氨酸,苯丙氨酸,组氨酸,精氨酸,脯氨酸含量均高于非转基因大豆,差异有统计学意义(P<0.05),所测得转基因大豆中氨基酸含量均不低于非转基因大豆,不同批次的大豆种子培植出的大豆氨基酸含量不存在显著性差异。
  
  大豆的氨基酸含量总和基本等于其蛋白质的含量,回收率>95%。间接证明了本方法检测大豆中氨基酸含量的准确性。
  
  3 讨论
  
  本实验通过对大豆中氨基酸分析的水解方法进行研究,在水解液中加入巯基乙酸,防止了蛋氨酸在传统酸水解方法中的氧化损失,分析步骤相对简单,重现性好,节省前处理时间,回收率较高。大豆中氨基酸含量总和基本等于其蛋白质的含量,证明了本方法检测大豆中氨基酸含量的准确性。
  
  本研究通过氨基酸分析仪对转基因农作物实验基地的非转基因和转基因大豆样品中的16种氨基酸进行分析,转基因大豆中的氨基酸含量稳定且均不低于非转基因大豆,富含的优质蛋白质可以满足人体健康需要。
  
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