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副干酪乳杆菌N1115对剖腹产幼儿肠道健康影响的研究

更新时间:2020-12-24 08:18点击:

  摘    要:
  
  目的 研究副干酪乳杆菌N1115对剖腹产出生婴幼儿肠道健康的影响。方法 在爱尔兰招募60名健康的剖腹产出生婴幼儿,年龄6~36月随机分为干预组和对照组,各30名。干预组服用N1115益生菌粉,对照组服用安慰剂,均为每日一袋,连续8w,并观察受试者的大便性状、胃肠症状、肠道菌群、短链脂肪酸以及不良事件发生情况。结果 两组均未发生与受试产品相关的不良事件。干预8 w后,干预组的胃肠气胀得分为1.86±2.28,较第0 w时下降,但与对照组比较无显著差异;大便性状、肠道菌群和短链脂肪酸水平,随着时间推移,整个样本集合无明显变化,各组之间没有显著性差异。细分受试者年龄,6~18月龄干预组的大便性状和胃肠气胀情况较对照组有一定差异。结论 副干酪乳杆菌N1115对婴幼儿的安全性良好,且对早期的肠道健康可能具有潜在的益生作用。[营养学报,2020,42(4):338-343]
  
  关键词:
  
  副干酪乳杆菌N1115 益生菌 婴幼儿 剖腹产 肠道健康
  
  生长发育是婴幼儿出生后的主要生理特征,其中,肠道的健康发育以及肠道微生物菌群的定殖平衡对婴幼儿的整体成长具有直接影响[1-2]。婴幼儿由于胃肠道功能、免疫功能发育不完善,抵抗力较弱,容易出现消化吸收不良等多种问题。研究表明,婴幼儿肠道微生物的定殖取决于多种因素,包括分娩方式、胎龄、喂养方式、产妇状况以及抗生素暴露等[3-6]。剖腹产新生儿由于缺少与母亲产道的接触,母婴间肠道菌群交换不充分,菌群建立明显区别于自然分娩婴儿[7-8],可能增加了此后患肥胖、糖尿病以及哮喘等疾病的风险[9-12]。因此,早期阶段的肠道菌群建立和平衡对婴幼儿乃至终身的健康至关重要。
  
  近年来,益生菌在婴幼儿食品中已有广泛应用,基本可分为两大类,一是促进肠道消化吸收,健康成长;二是改善免疫力,预防多种疾病[13-16]。在肠道菌群稳态平衡方面,越来越多的证据表明益生菌可通过调节微生物的多样性使宿主受益,益生菌干预无菌动物模型能够增强其肠道功能、促进粘膜免疫成熟,提高机体防御能力[17-18]。副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei,Lp)N1115是从内蒙古传统发酵乳制品中分离的一株益生菌,具有良好的耐酸耐胆盐、粘附、促进肠细胞生长和调节细胞免疫增强机体抵抗力等特性[19-24]。在乳鼠动物模型研究中显示,Lp N1115的早期干预可促进肠上皮细胞增殖、分化以及肠粘膜功能的建立,提示其在机体的早期肠道发育方面有促进作用[25]。因此,基于肠道健康对婴幼儿营养吸收和生长发育的重要性及Lp N1115对生命早期肠道发育的有益功能,本研究在爱尔兰开展了针对婴幼儿人群的益生菌试食试验,观察Lp N1115对剖腹产出生婴幼儿肠道健康的影响,研究益生菌摄入对婴幼儿肠道菌群建立的作用。
  
  1 对象与方法
  
  1.1 材料
  
  N1115益生菌粉,主要成分为Lp N1115和麦芽糊精,含量2.4×109 CFU/g,每袋2 g,安慰剂,主要成分为麦芽糊精,每袋2 g,由石家庄君乐宝乳业有限公司提供,0~4℃冰箱保存。
  
  1.2 对象
  
  在爱尔兰招募剖腹产出生的婴幼儿志愿者为研究对象。研究方案通过爱尔兰科克大学临床研究伦理委员会(Clinical Research Ethics Committee,University College Cork,Ireland)审批,并遵照Helsinki宣言精神,所有志愿者、其父母/监护人在试验开始前均被告知整个研究过程并签署知情同意书。
  
  1.2.1 纳入标准:
  
  剖腹产出生的年龄在6月至3周岁的男性/女性;家长/监护人已签订书面知情同意书;身体健康状况良好。
  
  1.2.2 排除标准:
  
  目前正在服用益生菌/益生元,或在过去2 w内服用;不愿在研究期间避免使用益生菌/益生元;对食物或研究产品中任何一种成分过敏,包括牛奶蛋白过敏和牛奶过敏;有严重的急性/慢性共存病(心血管、胃肠、内分泌、免疫、代谢或任何禁忌症);被认为会干扰研究目的造成安全风险或混淆研究结果的其他情况或服用药物;在过去3月服用抗生素(或过去6月有服用抗生素记录);不能接受试验药物干预的对象;受试者在这项研究开始前的60 d内参加/完成其他研究;在筛选随访期前30 d内接触过任何未经注册的药物产品。
  
  1.3 试验方法
  
  1.3.1 试验设计及分组:
  
  本试验采用区组随机化方法在爱尔兰招募60名婴幼儿,并对所有研究人员和受试者进行盲法分配。整个研究分为干预组和对照组,每组30人,分别食用N1115益生菌粉或安慰剂,每日一袋,用温水/牛奶冲调饮用,连续饮用8 w。
  
  1.3.2 观察指标:
  
  父母/监护人每日进行日常症状记录,包括大便性状(排便次数、粪便状态)和胃肠症状(腹疼次数、腹胀次数和胃肠气胀次数),大便性状参考布里斯托大便分类法(Bristol stool scale)[26]。组织受试者在试饮前、试饮4 w及试饮8 w进行回访,回访时收集日常症状记录,依据每日记录分析受试者的胃肠道健康状况,并统计是否出现不良反应等。
  
  1.3.3 肠道菌群检测:
  
  父母/监护人于回访前一日晚上或当日早上收集受试者的粪便样本,样本量不少于1 g,置于取样盒中冷藏送至回访点,-20℃保存,用于肠道菌群及粪便水代谢组学分析。采用QIAamp DNA Stool Mini Kit(德国QIAGEN)提取总DNA,以16S r RNA可变区V3-V4区域为目标基因,设计扩增引物:正向引物5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGG-GNGGCWGCAG-3’;反向引物5’-GTCTCGTGGGCTCGG-AGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3’,制备16S r RNA基因文库,采用Mi Seq测序平台(美国Illumina)检测粪便中微生物群的多样性。上述检测均由爱尔兰农业与食品发展部TEAGASC食品研究中心完成。
  
  1.3.4 粪便水代谢组学分析:
  
  称取0.2~0.4 g粪便置于无菌离心管,加入0.4~0.8 ml无菌磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS),充分匀浆,16000 g离心30 min取上清液,Corning®Costar®Spin-X®centrifuge filters0.2µm(美国Merck)过滤上清液至澄清,-20℃保存,或直接用于气相色谱-质谱联用(gas-chromatography mass spectrometry,GC-MS)分析。粪便上清液均由丹麦MS-OMICS公司完成检测。
  
  1.3.5 不良事件:
  
  不良事件(adverse events,AEs)由父母/监护人报告,并由试验组织方进行评估和分级(表1)。
  
  1.4 统计学分析
  
  数据分析均依据意向性治疗原则(intention to treat,ITT)[27]。采用SPSS v.24软件进行描述性分析和混合ANOVAs分析,混合ANOVAs分析的假设不成立时,采用R Studio v.1.1.456软件进行20%修剪均值的混合ANOVA分析。以P<0.05表示差异具有统计学意义。
  
  2 结果
  
  2.1 入组对象基本情况(表2,3)
  
  共筛选61名受试者,1名筛选失败,确定60名参与随机分组,干预组30人,对照组30人。干预8 w期间,2名受试者退出(干预组29人,对照组29人),无受试者因严重的不良事件(serious adverse events,SAEs)或者可疑非预期严重不良反应(suspected unexpected serious adverse reaction,SUSARs)退出研究,无受试者失访。两组受试者在年龄、性别、病史和服药情况的分布情况(表2),整个研究中随机化得到很好地平衡。所有受试者的身高和体质量在干预其间的变化(表3),两组受试者在第0、4、8 w时均无显著差异。
  
  2.2 观察指标比较(表4)
  
  随时间推移整个样本集合无明显变化,干预组和对照组之间没有显著性差异(P=0.75);然而仅分析6~18月龄婴幼儿的大便性状,3个时间点的记录数据显示在干预组大便性状由第5型(柔软的半固体)向第3、4型(正常)转变,对照组则向第5型(柔软的半固体)转变后恢复原状态。胃肠气胀观察结果同样显示,整个样本集合无明显变化,干预组和对照组之间没有显著性差异(P=0.07);但分析6~18月龄婴幼儿的胃肠气胀状况,干预组维持稳定,对照组则在3~4w时胃肠胀气增加然后恢复至初始低水平。
  
  2.3 肠道菌群变化比较(表5)
  
  分别在3次回访时收集受试者粪便,检测肠道菌群变化,包括放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、疣微菌门。比较所有受试者的样本集合,放线菌门、拟杆菌门和厚壁菌门水平,随着时间推移,整个样本集合无明显变化,干预组和对照组之间没有显著性差异(P=0.51,P=0.51,P=0.24)。
  
  2.4 短链脂肪酸水平比较
  
  除肠道菌群分析,同时将粪便用于短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)含量检测,包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸(图1)。上述短链脂肪酸水平随着时间推移,整个样本集合无明显变化,干预组和对照组间没有显著性差异。
  
  Fig.1 Comparison of intestinal contents of SCFAs between two groups
  
  2.5 不良事件
  
  两组受试者均未发生严重不良事件,且经医学人员判断已记录的不良事件与本研究提供的产品无关。
  
  3 讨论
  
  新生儿肠道菌群的建立起始于母-婴垂直传播,伴随着孕期营养、分娩和哺乳方式等不同,其表现出个体差异[28]。婴幼儿期是肠道菌群建立的关键时期,由于肠道及其粘膜定植菌群不成熟、免疫系统不完善等,易发生胃肠道疾病、病原体感染、过敏性疾病等。肠道菌群在最初的发育阶段以双歧杆菌占主导优势,乳杆菌约占20%左右,如副干酪乳杆菌、格氏乳杆菌、唾液乳杆菌和鼠李糖乳杆菌等[29-30];随后其微生物多样性逐渐增加,至31月龄后趋于稳定[31]。随着对母乳活性成分、肠道菌群组成、益生菌安全性及健康功能等的深入研究,已表明益生菌在人体的不同年龄段均可发挥重要作用。Tabbers等[32]研究显示,短双歧杆菌能够有效地增加便秘儿童的排便次数、改善大便一致性并减少儿童腹痛。研究不同摄入量对益生菌定植的影响,结果显示鼠李糖乳杆菌LGG的摄入量为108~1010 CFU/d均可在早期婴儿肠道内定植,耐受性良好[33],且能够促进肠道菌群平衡、改善过敏[34]等。
  
  目前,我国批准的可用于婴幼儿食品的益生菌株有嗜酸乳杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和发酵乳杆菌,具有调整肠道功能和菌群平衡、提高免疫力、改善乳糖不耐、预防和治疗过敏等功能[34-38]。本研究中,食用N1115益生菌粉和安慰剂的婴幼儿均未发生与产品相关的不良事件,适应性良好,也表明了Lp N1115对婴幼儿人群具有良好的安全性。在婴幼儿中,粪便硬度的增加和排便频率的降低与出生后年龄和肠道的成熟有关[39-40]。本研究中两组受试者每日的大便性状无明显差异,但Lp N1115的干预对0~18月龄受试者的大便性状和胃肠症状有一定改善,变化趋势与Smilowitz等[41]的研究相似,与母乳喂养组相比,补充长双歧杆菌婴儿亚种后婴儿排出软便的频率更高,水样便减少。提示Lp N1115对婴幼儿早期的肠道健康可能具有潜在作用,但仍需进一步研究验证。
  
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