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妊娠期糖尿病与孕晚期肠道微生物的关联性研究

更新时间:2020-12-24 08:19点击:

  摘    要:
  
  目的 比较妊娠期糖尿病(GDM)孕妇和非GDM孕妇孕晚期肠道微生物组成的差异,并探索影响肠道微生物相对丰度的因素。方法 共纳入GDM孕妇19例,非GDM孕妇20例;问卷法收集参与者的年龄、身高、孕前体重等信息;选择16S rDNA V3~V4区域进行测序,测序平台为Illumina Miseq PE3000。结果 与非GDM组相比,GDM组的平均年龄更大(P=0.017)、孕前体质指数(BMI)更高(P=0.032)。两组的Alpha多样性和Beta多样性无显著性差异。Betaproteobacteria在GDM组中相对丰度较高;Gammaproteobacteria在GDM组中相对丰度较低。Blautia与孕前BMI呈显著负相关(P=0.036)。结论 GDM与肠道微生物的组成变化有关。未来可通过观察肠道微生物的动态变化,研究GDM的发生发展及预防控制。[营养学报,2020,42(4):344-349]
  
  关键词:
  
  妊娠期糖尿病 肠道微生物 孕前体质指数
  
  妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是最常见的妊娠并发症之一,定义为妊娠期间首次发现的葡萄糖耐受不良[1]。随着经济水平的提高和膳食结构的改变,全球GDM的患病率呈逐年递增趋势。我国2010年至2017年GDM的发病率高达14.8%[2]。GDM可导致多种不良妊娠结局,包括巨大儿、早产、产后出血、新生儿呼吸窘迫综合征等[3]。同时Meta分析也表明GDM患者在产后10年内发展为二型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)的风险是普通孕妇的10倍。
  
  越来越多的证据表明,肠道微生物与包括T2DM在内的多种代谢疾病存在关联[4]。例如与正常对照组比,T2DM患者Firmicutes和Clostridia相对丰度显著降低[5-6];超重女性Bacteroides和Staphylococcus的相对丰度显著高于正常体重的女性[7]等。由此推测GDM有可能影响肠道微生物的组成。
  
  目前关于肠道微生物和GDM关联的研究较少,本研究采用Illumina-Miseq高通量测序技术获取粪便中肠道微生物的信息,比较GDM孕妇和非GDM孕妇孕晚期肠道微生物的差异,并探索影响肠道微生物相对丰度的因素,为从肠道微生物的角度出发,促进孕产妇健康提供更多理论依据。
  
  1 对象与方法
  
  1.1 对象
  
  本研究经华中科技大学同济医学院伦理委员会批准,研究对象均签署知情同意书。研究人群来源于湖北省武汉市同济母婴健康队列(Tongji Maternal and Child Health Cohort,TMCHC),自2016年11月30日至2018年7月30日,共收到19名GDM孕妇和20名非GDM孕妇的粪便样品。纳入标准:年龄≥18周岁;单胎;孕前体质指数(body mass index,BMI)<28 kg/m2;已行75 g口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test,OGTT);基本情况完整;无严重系统性疾病;无既往糖尿病史;近1月内无胃肠道不适,无抗生素、益生菌制剂及其他药物使用史;饮食规律稳定。
  
  1.2 方法
  
  1.2.1 资料收集:
  
  孕周<14 w的孕妇被纳入TMCHC时,在调查人员的指导下完成调查问卷,收集年龄、身高、孕前体重、末次月经等信息。使用孕前体重除以身高的平方计算孕前BMI。
  
  参与者于孕24~28 w进行GDM筛查,同时收集孕中期体重和膳食信息。基于国际糖尿病与妊娠研究组(International Association of Diabetes and Pregnancy Study Group,IADPSG)[8]的标准,OGTT满足以下任意一条则可诊断为GDM:空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)值≥5.1 mmol/L,1-h血糖≥10.0 mmol/L,2-h血糖≥8.5 mmol/L。孕期平均每周增重可计算为:(孕中期体重-孕前体重)/中期体重测定时的孕周。
  
  1.2.2 样本采集:
  
  参照国际人类微生物组标准项目(International Human Microbiome Standards Project,IHMS)的采样方法。孕24~32 w,孕妇通过无菌棉签采集5~10 g新鲜粪便,装入无菌采样袋中。采样袋不封闭,和厌氧产气袋(Anaero Pack,日本三菱)一并放在密闭盒子里,由取样人员上门取样,并于4 h内送至实验室分装进无菌冻存管中,保存于-80℃备用。
  
  1.2.3 DNA提取、文库制备与测序:
  
  采用E.Z.N.A Stool DNA Kit(Omega Bio-tek)粪便提取试剂盒,按照说明书操作。提取的DNA用Nanodrop微量紫外分光光度计(ND-1000,Thermo)测定纯度及浓度。本研究选择16S r DNA V3~V4区域进行测序,引物为341F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'),806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')。测序平台为Illumina Miseq PE3000。
  
  1.3 生物信息学分析
  
  1.3.1 操作分类单元及Alpha多样性分析:
  
  利用Usearch在0.97的相似度下对序列进行聚类,得到用于物种分类的操作分类单元(operational taxonomi units,OTU)。基于OTU聚类结果,采用sobs指数(表示实际观测到的OTU的数量,指数越大,群落丰富度越高)、chao1指数(估计样品所含OTU的总数,指数越大,群落丰富度越高)、shannon指数和simpson指数(估算微生物群落的多样性,指数越大,群落多样性越高)分别对两组进行Alpha多样性分析。
  
  1.3.2 Beta多样性分析:
  
  Beta多样性分析用来比较两组样品在微生物多样性方面存在的差异大小,比较的基本输出是一个距离矩阵。本研究采用了主坐标分析(principal co-ordinates analysis,PCo A)。
  
  1.3.3 显著性差异分析:
  
  根据获得的群落丰度数据,在门至属的水平上,运用LEf Se分析方法发现在两组微生物群落中表现出丰富度差异的物种,并进行假设性检验,评估差异的显著性。
  
  1.4 统计学分析
  
  采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料用±s表示,组间差异采用t检验;不符合正态分布的计量资料用P50(IQR)表示,组间差异采用独立样本非参数检验;计数资料用n表示,组间差异采用Fisher精确检验。Alpha多样性指数的比较采用wilcoxon秩和检验;Beta多样性的比较采用多元方差分析;相关性分析采用Spearman相关性检验。统计学检验以P<0.05为差异具有统计学意义。生物信息学分析采用美吉生物信息云平台(http://www.isanger.com/)进行分析。
  
  2 结果
  
  2.1 基本情况(表1)
  
  GDM组的年龄、孕前BMI、FPG、1-h及2-h的血糖值均高于非GDM组,且经产妇比例更高,收样孕周和孕期平均每周增重在两组之间无统计学差异。
  
  2.2 膳食比较(表2)
  
  与非GDM组相比,GDM组粗粮、水产品、叶菜和油脂类坚果的摄入量较多,米面制品、禽畜肉和水果的摄入量较少。
  
  2.3 操作分类单元及Alpha多样性分析(图1)
  
  39个样本,共得到有效序列1164237条,鉴定出OTU 510个。将至少在3个样品中出现且序列数≥5的物种保留,并按最小样本序列数抽平,得到序列数495066条,OTU 328个,测序样本Coverage指数均大于0.99。结果显示,GDM组与非GDM组的Alpha多样性指数不存在统计学差异。与非GDM组相比,GDM组的Alpha多样性指数变异度较大。
  
  2.4 Beta多样性分析(图2)
  
  基于Bray-Curtis距离的OTU水平的PCo A分析未观察到两组菌群分布具有明显的分离,p MANOVA检验,F=1.07,P=0.366。PCo A坐标轴中PC1和PC2的解释率分别为17.26%和11.54%。
  
  Fig.1 Alpha diversity analysis
  
  Fig.2 PCo A analysis based on OTU abundance
  
  2.5 显著性差异分析(图3,4)
  
  在细菌门的水平上,未显示两组中存在显著性差异的菌群。相对丰度最高的两个细菌门分别是Bacteroidetes和Firmicutes。Bacteroidetes在GDM组和非GDM组中的相对丰度分别为59.50%、51.23%;Firmicutes在GDM组和非GDM组中的相对丰度分别为33.80%、40.75%。
  
  通过LEf Se分析,从纲水平到属水平,在组间丰度有差异的节点18个。Gammaproteobacteria和下属的Enterobacteriales及Enterobacteriaceae在非GDM组中相对丰度较高;Betaproteobacteria和下属的Burkholderiales及Alcaligenaceae在GDM组中相对丰度较高;有一组Firmicutes下属的细菌,从纲至属水平的相对丰度在非GDM组中均高于GDM组中,但没有比对到已知菌种;此外属水平的Lachoclostridium、Ruminococcus_gnavus_group、Blautia和Peptostreptococcaceae的相对丰度在非GDM组中较高。
  
  Fig.3 LEf Se multi-level species hierarchy tree diagram
  
  Fig.4 LDA discriminant result
  
  2.6 相关性分析(图5)
  
  Fig.5 Spearman correlation analysis
  
  Fig.5 Spearman correlation analysis
  
  Spearman相关性分析显示,Blautia与孕前BMI(调整了年龄和FPG)呈显著负相关(r=-0.346,P=0.036);Lachnoclostridium与FPG(调整了年龄和孕前BMI)和孕期平均每周增重(调整了年龄、孕前BMI和FPG)均呈显著负相关(r分别为-0.422和-0.456,P值分别为0.009和0.006)。
  
  3 讨论
  
  人体肠道中大约有1013~1014个微生物,主要是细菌,在代谢及各种疾病的发生发展中扮演着重要角色。妊娠期机体各系统生理生化变化显著,与肠道微生物相互作用。GDM作为妊娠期常见并发症,其主要特点是糖耐量受损。以往研究表明,T2DM患者肠道微生物和正常对照组存在差异,其肠道微生物较为紊乱,有益菌群丰度减少,而机会致病菌丰度增加。因此,探索GDM患者与健康对照者肠道微生物是否有类似差异对于病因探索及预防、治疗策略具有意义。
  
  本研究比较了GDM孕妇和非GDM孕妇孕晚期肠道微生物组成的差异,这些差异主要表现在纲至属的水平上。尽管GDM组的孕期膳食经过控制,但控制饮食后的肠道微生物仍表现出糖尿病样菌群特征。孕前BMI及孕期平均每周增重均可对肠道微生物的相对丰度产生影响。
  
  在Alpha多样性指数上,GDM组与非GDM组间无显著性差异,与之前的研究结果类似[9-11]。GDM组Alpha多样性指数的变异度较大,与T2DM患者chao1指数的研究结果相反[5]。在Beta多样性指数上,两组在基于OTU水平的PCo A图未显示出明显的聚类,p MANOVA检验也并无统计学差异。一项收集孕妇产后3~16月粪便的研究表明[9],GDM组与非GDM组微生物整体构成也无显著差异。2012年Koren等[12]研究显示,孕前超重、肥胖及患有GDM并不是造成孕期Beta多样性增加的主因。
  
  随后进一步通过通过LEf Se分析来寻找两组间相对丰度具有显著差异的菌群。在门水平上,没有观察到具有统计学差异的细菌,但GDM组Bacteroidetes的相对丰度较非GDM组高,Firmicutes的相对丰度较非GDM组低,与以往研究报道的结果一致[13-14]。Bacteroidetes被认为是传染病中的机会性病原体,且变异度大,发展抗药性的潜力较强[15]。此外,Firmicutes相对丰度的降低,会使初级胆汁酸转化为次级胆汁酸的过程受阻,减弱胆汁酸对胰岛素的增敏作用,从而严重影响体内糖、脂肪代谢[16]。在纲水平上,GDM组Betaproteobacteria的相对丰度较非GDM组显著增高,同样的结果在一项研究T2DM患者与对照人群肠道微生物差异的文献中报道过[5]。在科水平上,GDM组Enterobacteriaceae的相对丰度显著降低。研究显示,Enterobacteriaceae的失调也会导致一系列慢性疾病,例如结肠炎和克罗恩病等[17]。在属水平上,非GDM组Blautia的相对丰度较GDM组显著增高,在其他T2DM的研究中显示其在正常对照中丰度更高[11,14]。在一项二甲双胍与中药改善T2DM患者肠道微生物的RCT研究中,二甲双胍组和中药组Blautia的相对丰度均显著增加[18]。
  
  在相关性分析中显示,较高的孕前BMI和孕期平均每周增重者Blautia和Lachoclostridium的相对丰度显著降低,推测体重可能是一个促使母体肠道微生物发生变化的因素。Collado等研究[19]也显示孕期肠道微生物受孕前BMI和怀孕期间体重增加的影响。
  
  本研究没有利用q PCR对热点菌群进行定量分析,是一个不足。此外,本研究的设计是病例对照,无法证实菌群与GDM发病之间的动态及因果关系,且样本量偏少,对于较小的变异缺乏鉴别能力。因此未来还有待于大样本的研究以及多组学的结合,更加全面立体的来探索菌群与疾病之间的关联,为疾病的预防和控制提供证据。
  
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