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宏基因组学揭示海南地区结直肠癌病人肠道微生物组特征

更新时间:2021-04-13 08:45点击:

  摘    要:
  
  目的:对海南地区结直肠癌病人肠道微生物组特征进行注释鉴定,寻找生物标志物。方法:收集来自海南地区初次诊断为结直肠癌的病人6例,健康对照7例,通过宏基因组测序,揭示结直肠癌病人的肠道细菌组成结构和代谢通路,潜在代谢产物,抗生素抗性基因富集特征。结果:结直肠癌病人肠道细菌群落结构发生显著变化,共有6个富集菌种,分别是:Parvimonasmicra,Flintibacter sp. KGMB00164,[Ruminococcus] gnavus,Fusobacteriumnucleatum,Porphyromonasasaccharolytica和Flavonifractorplautii。通过对代谢通路注释,发现在结直肠癌病人中共有4个通路富集,与有氧呼吸,3-苯丙酸和3-(3-羟基苯基)丙酸的降解和L-赖氨酸发酵生产乙酸和丁酸酯有关。通过代谢产物预测,显示结直肠癌病人肠道丁酸盐含量较低。通过对抗生素抗性基因的注释发现,所有差异性抗生素抗性基因均在结直肠癌病人肠道中富集,主要包括磺胺类,β-内酰胺酶类和四环素类抗生素抗性基因。结论:海南地区结直肠癌病人的肠道细菌标志物与其他国家和地区结直肠癌病人的生物标志物相似,但又有地区特征。细菌和抗生素抗性基因生物标志物或可用于结直肠癌筛查、预后和治疗效果评价。
  
  关键词:
  
  海南省 宏基因组 结直肠癌 肠道微生物组 生物标志物
  
  The characterization of inteatinal microbiota in the colorectal cancer patients from Hainan as revealed by metagenomic sequencing
  
  TANG Yun-qing MA Chen-chen CHEN Jin-xiong XIONG Wei CHANG hai-bo ZHANG Zeng ZHANG Jia-chao
  
  Department of Medical Supervision and Management, Haikou people's Hospital; College of Food Science and Engineering, Hainan University; Department of Endocrinology Haikou people's Hospital;
  
  Abstract:
  
  Objective: To investigate the characteristics of intestinal microbiota in the colorectal cancer(CRC patients in Hainan Province and identify the potential microbial biomarkers for the disease. Methods: Six patients with CRC and 7 healthy controls from Hainan were recruited in this study. The intestinal microbiota and its potential metabolic pathways were determined by metagenomic sequencing. Results: The results showed that the structure of the intestinal microbiota was markedly altered in the patients with CRC. Six bacteria, including Parvimonasmicra,Flintibacter sp. KGMB00164, [Ruminococcus] gnavus, Fusobacterium nucleatum, Porphyromona sasaccharolytica and Flavonifractorplautii were more abundant in the patients than in the healthy subjects. Four metabolic pathways associated with aerobic respiration, 3-phenylpropanoate and 3-(3-hydroxyphenyl)propanoate degradation and L-lysine fermentation to acetate and butanoate were markedly enriched in CRC patients,. By contrast, the metabolic pathway of butyrate was lower in patients with CRC by comparing the metabolites of gut microbiota between groups. Three antibiotic resistance genes, such as sulfonamides, β-lactamases and tetracyclines, were differential between two groups,and all of them were significantly enriched in CRC patients. Conclusion: The intestinal bacterial biomarkers for CRC patients in Hainan were similar to the biomarkers of CRC patients previously observed in other countries and regions.Biomarkers based on intestinal bacterial composition and antibiotic resistance genes might be useful for early diagnosis of CRC, prognosis and evaluation of therapeutic efficacy.
  
  Keyword:
  
  Hainan; Metagenome; Colorectal cancer; Inteatinal rmicrobiota; Biomarkers;
  
  结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是世界上最广泛的癌症之一,预计2020年美国男性发病数和死亡数仅次于前列腺癌和肺癌,女性发病数和死亡数仅次于乳腺癌和肺癌,死亡率预计近半[1-2]。研究表明通过肠道微生物组生物标志物的检测可实现例如痛风[3],肝硬化[4],以及结直肠癌的甄别[5]。得益于早期检测,结直肠癌的发病率逐渐放缓[2],然而,由于全球多样化的饮食方式,不同的民族和宿主基因型以及环境因素,使得各个国家和地区的居民肠道微生物组存在明显不同[6-8],并导致临床肠道微生物组标志物的差异,并且彼此之间的标志物可能不通用[9]。目前研究表明促进结直肠癌发展,并可用于早期检测结直肠癌的微生物组标记物包括Fusobac‐teriumnucleatum[9-11],Bacteroidesfragilis[9,12],Esche‐richia coli[13-14],Clostridium symbiosum[15]等。然而,在进行结直肠癌早期检测时,应充分考虑当地人群肠道微生物组特征[9],因此拓展对特定地区结直肠癌病人肠道微生物组标记物的鉴别极其重要。
  
  海南岛气候湿热,独特的黎族饮食习惯一同塑造了具有热带岛屿地区特征的居民肠道微生物组[16]。而针对海南地区结直肠癌病人肠道微生物组的数据未有报道。不仅如此,目前对肠道微生物组的解析多见于细菌和真菌多样性测序的微生物注释,其结果仅能精确到物种属水平,本研究通过宏基因组测序,可以更精准地从种水平的角度阐释结直肠癌病人肠道菌群组成,并进一步注释了代谢通路和抗生素抗性基因组成。本研究客观详实展示了海南地区结直肠癌病人肠道微生物组特征。
  
  1 材料和方法
  
  1.1 研究队列招募
  
  研究队列来自2019年6月至2019年12月年内海口市人民医院的肠镜受检者。期间确诊结直肠癌病人并纳入肿瘤组共计6例[6名男性,年龄(61.33±16.12)岁,BMI为(20.79±1.49)],健康对照7例[均为男性,年龄(62.57±8.68)岁,BMI为(21.24±1.01)],肿瘤组所有病人均符合结直肠癌的诊断标准[17],且所有病人均为初次诊断为结直肠癌未经任何抗肿瘤治疗。健康组为到院体检的本地市民,BMI介于18到24。所有志愿者无严重心脏、肝、肺功能障碍,也无胃肠道疾病(例如炎症性肠病,肠易激综合征等)和慢性代谢性疾病(例如糖尿病、痛风等)。所有志愿者近期没有服用过任何影响肠道菌群的药物和益生菌制剂(例如,二甲双胍、质子泵抑制剂、黄连素、导泻剂等)。肿瘤组和健康组之间年龄和BMI均无显著性差异,既往史上均无其他重大疾病,均无结直肠癌家族史。除此之外,在采集粪便之前3个月之内所有志愿者均未接受过抗生素治疗,平时无益生菌等微生物制剂食用习惯。结直肠癌病人均为初次确诊疾病,所有志愿者均被告知本研究流程,且均已签署知情同意书,所有程序符合海口市人民医院制定的伦理标准(HKH-EC-FS28)。
  
  1.2 粪便收集与DNA提取、测序和质控
  
  所有志愿者的粪便样品取自服用泻剂进行肠镜之前,收集到志愿者新鲜粪便立即置于-80℃保存,利用细菌基因组DNA提取试剂盒(康为世纪生物科技有限公司,CW0552)完成DNA提取,用Nanodrop通过OD260/280比值检测纯度并用Qubit 2.0对DNA浓度进行精确定量,而后进行宏基因组学测序,测序工作由北京诺禾致远生物有限公司完成,测序仪器为Illumina Hi Seq2500,制备片段长度约为300 bp的文库。使用正向和反向的150 bp产生成对序列,使用Trimmomatic v_0.36去除原始数据中低质量的序列,利用Bowtie2[18]去除人类宿主的基因组(hg38数据库)用于下游分析[19]。
  
  1.3 物种鉴定、代谢通路注释和肠道菌群代谢物预测
  
  肿瘤组与健康对照组志愿者肠道菌群细菌组的注释采用Kraken 2.0[20]和Bracken 2.0[21]完成,测序读长为150 bp,其余为默认参数。代谢通路的注释使用HUMAn N2[22],选用的是Uni Ref90 EC过滤后数据库,其余为默认参数。肠道菌群代谢物的预测结果是根据HUMAn N2的输出结果,利用Melon‐npan[23],采用默认参数获得。
  
  1.4 抗生素抗性基因注释
  
  抗生素抗性基因的注释利用Bowtie2[18],基于抗生素抗性基因数据库完成[24]。
  
  1.5 统计学方法
  
  所有志愿者肠道菌群宏基因组测序原始数据已上传至NCBI公共数据库(宏基因组数据ID:PRJNA608088)。Wilcoxon秩和检验用于比较两组之间的差异性的细菌和抗生素抗性基因。差异性细菌的P值阈值选定为0.01,差异性代谢通路的P值阈值选定为0.01,抗生素抗性基因的P值阈值选定为0.05。数据处理主要依据R软件实现,中心对数转换(CLR转换)通过compositions完成[25],主坐标分析图(PCo A图)和箱型图分别通过R软件的ggord和ggplot的脚本实现可视化,Adnois通过vegan进行检验,Aithsion距离也通过vegan进行计算,小提琴图通过vioplot实现,热图通过pheat‐map完成。
  
  2 结果
  
  2.1 测序数据覆盖度
  
  13个样品共产生82.74 G的原始数据,其中肿瘤组测序产出原始数据共40.29 G[数据量为(6.72±0.59) G,最小5.92 G,最大7.75 G;序列数为(22 385 162±1 976 829)条,最小19 738755条,最大25 845 043条]。对照组测序产生原始数据共42.45 G[数据量为(6.07±0.42) G,最小5.25G,最大6.66 G;序列数为(20 252 056±1 415 158)条,最小17 490 062条,最大22 209 433条]。通过对细菌基因组进行注释,肿瘤组共(93.2%±3.24%)序列被鉴定到种细菌水平,对照组共(95.31%±1.22%)序列被鉴定到种细菌水平。综上可见测序深度与比对结果可满足分析要求。
  
  2.2 结直肠癌病人肠道细菌多样性变化
  
  为了更好地体现肠道微生态环境下的细菌结构,对经过Bracken注释到的细菌相对丰度进行了CLR转换,得到CLR含量。基于相对含量计算肿瘤组和健康对照组志愿者肠道细菌的alpha多样性,发现Shan‐non和Simpson多样性指数均没有显著性差异(图1A和图1B)。基于CLR含量,计算了Aithsion距离之后,进行主坐标分析,用于展示两组之间的肠道细菌结构是否具有显著差异,结果如图1C所示,两组各自聚类明显,很清晰地观察到结直肠癌病人肠道细菌结构已经发生了显著的变化,通过严格的Adnois检验(P<0.001,F=2.414),结果同样表明两组之间的肠道细菌结构显著不同。
  
  2.3 差异性菌种
  
  通过上述分析发现,结直肠癌病人肠道细菌结构已经发生了显著的变化。为了更清楚地展示具体的变化,基于CLR含量,找到两组之间的差异性菌种。为了更好地关注具有一定核心地位的菌种,选取在富集组相对含量大于百分之一的菌种纳入本研究的比较结果。结果表明结直肠癌病人相对于健康志愿者之间共24个差异性菌种,其中18个在结直肠癌病人中显著降低,6个菌种在结直肠癌病人肠道中显著富集(图2),富集的菌种分别是:Parvimonasmicra,Flintibacter sp.KGMB00164,[Ruminococcus]gnavus,Fusobacteri‐umnucleatum,Porphyromonasasaccharolytica和Fla‐vonifractorplautii。
  
  图1 结直肠癌病人肠道细菌alpha和beta多样性分析
  
  图2 差异性菌种
  
  2.4 差异性代谢通路及代谢产物
  
  丰富的肠道微生物编码着各式各样的代谢功能基因,通过对代谢通路注释,发现在结直肠癌病人中共有4个通路富集,分别与有氧呼吸,3-苯丙酸和3-(3-羟基苯基)丙酸的降解和L-赖氨酸发酵生产乙酸和丁酸酯有关(图3)。为进一步找到潜在的差异性代谢产物,使用Melonnpan对代谢产物进行预测,结果表明,2种代谢产物(羟基苯乙胺和胆甾烯酮)在肿瘤组富集,8中代谢产物(烟酸,瓜氨酸,次黄嘌呤,丙酸咪唑,甲基黄嘌呤,丁酸盐,甲基鸟嘌呤和尿嘧啶)在健康组富集。
  
  图3 差异性代谢通路与代谢产物
  
  2.5 肠道细菌抗生素抗性基因分析
  
  抗生素抗性基因对于细菌抵御外界抗生素干扰至关重要,影响着肠道菌群的结构,过度抗生素的使用有利于具有该类抗生素抗性基因细菌的富集。为更好地揭示结直肠癌病人肠道细菌编码的抗生素抗性基因,对其进行严格的注释,并选取了至少在三分之二的志愿者中检测的抗性基因纳入鉴定结果,以减少由于样本量与样本个体差异带来的不确定因素。通过比较肿瘤组和健康组肠道细菌所编码的抗生素抗性基因,共发现了9类,13种抗生素抗性基因具有显著差异,且全部在结直肠癌病人肠道中富集(表1),分别是sul1(磺胺类),TEM-34(β-内酰胺酶类),arr-3,mph A,aad A5,TEM-157(β-内酰胺酶类),TEM-168(β-内酰胺酶类),TEM-76(β-内酰胺酶类),tet B(60)(四环素),CRP,TEM-220(β-内酰胺酶类),tol C和acr B。其中有4种抗生素,7种抗生素抗性基因在健康志愿者中没有检测到,分别是:TEM-34(β-内酰胺酶类),arr-3,mph A,aad A5,TEM-157(β-内酰胺酶类),TEM-168(β-内酰胺酶类)和TEM-76(β-内酰胺酶类)。由此可见,结直肠癌病人肠道细菌的对抗生素的抗性较强,特别是β-内酰胺酶类抗生素。
  
  表1 肠道微生物差异性抗生素抗性基因
  
  3 讨论
  
  尽管目前多个研究关注了结直肠癌病人肠道微生物组特征[5,26-27],但是不可逃避的问题是,不同国家和地区的队列研究表明生物标志物存在差别。香港中文大学的于君教授团队通过多队列的比较,构建了能够应用于多队列的预测模型[9],但是所包含的队列具有显著的西方生活习惯(尽管包括中国香港队列),然而民族,生活饮食习惯等会对肠道菌群产生极大影响,因此,有必要对特定地区的结直肠癌病人的肠道微生物特征进行比较研究,拓展生物标志物,构建符合一定区域的预测模型。
  
  本研究从肠道细菌角度,首先证实了海南地区结直肠癌病人的肠道细菌组成与健康居民之间al‐pha多样性上不存在显著差异,而基于Aithsion距离表明了两组细菌组成结构之间存在显著差异,进一步细化了这种差异,发现了6个在海南地区结直肠癌病人中富集的菌种。进一步通过对代谢通路的注释,共发现4个在肿瘤组富集的代谢通路。代谢物预测结果展示了结直肠癌病人肠道中丁酸盐的含量可能会降低,然而丁酸盐及丁酸盐产生菌可以抑制肿瘤发展[28-29]。因此对结直肠癌病人可适当补充丁酸盐及产丁酸盐的益生菌。除此之外,由于抗生素的使用不当,会使得肠道菌群紊乱,并造成耐药菌的存在,影响肠道微生态环境,加速结直肠癌的发生发展,因此本研究表征了海南地区结直肠癌病人肠道细菌抗生素抗性基因的组成,结果表明可观察到的差异性抗生素抗性基因全部在结直肠癌病人肠道中富集。
  
  尽管本研究的队列规模小,结直肠癌病人仅6人,通过对细菌组成结构的分析,其高度聚类(P<0.001)使得有理由相信结直肠癌病人肠道菌群存在变异。对差异性富集菌种的甄别,包括Parvimonas‐micra[9,30],Fusobacteriumnucleatum[9-11],Porphyromo‐nasasaccharolytica[9]和Flavonifractorplautii[31-32]也可在同类研究中得到一致结论,而海南地区的结直肠癌病人的富集细菌标志物又有自己的特色,包括了Flintibacter sp.KGMB00164和[Ruminococcus]gna‐vus。这其中需要特别关注的是:Fusobacteriumnu‐cleatum能促进结直肠癌变[10,33-34],并抑制抗肿瘤的免疫表达[11,35],通过小鼠模型发现,Parvimonasmicra会增加肿瘤负荷[30],Flavonifractorplautii则通过降解黄酮类化合物增加患癌风险[32]。然而,目前通过宏基因组测序,对富集的代谢通路知之甚少,其与结直肠癌的发生发展的关系还需要进一步确定。肠道是抗生素耐药菌的储存库,无论是由于水平基因转移还是由于既往用药史导致的抗生素抗性基因富集,表征结直肠癌病人肠道微生物组都尤为重要。本研究对抗生素抗性基因的注释初步发现所有差异性抗生素抗性基因全部在结直肠癌病人中富集,而下一步更应对病人的抗生素用药史进行调查,判断抗生素的不合理使用对肠道菌群的破坏性作用及紊乱性肠道微生态可能导致结直肠癌的发生发展机制。但实现一个地区的结直肠癌早期筛查,仍需要更大规模的研究队列,减少混杂因素的干扰,提高预测准确度。着眼于海南地区结直肠癌病人的肠道微生物组,本研究通过详实客观的数据拓展了结直肠癌病人的肠道微生物组的生物标志物,或可用于结直肠癌筛查、预后和治疗效果预测。
  
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